今年5月发在NC上的文章
作者通过整合分析scRNA-seq数据、公开发表的scRNA-seq和bulk RNA-seq数据集、空间转录组数据、FACS、IF和免疫治疗的转录组数据，证实FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞的相互作用参与形成促结缔组织增生性TME，阻止淋巴细胞浸润，可能导致肿瘤免疫治疗抵抗，可以作为结直肠癌治疗的潜在靶点。
1. A single-cell transcriptomic atlas of paired human normal mucosa and CRC tissues.
作者对5名非转移性结直肠癌患者的肿瘤样本和邻近正常组织进行了单细胞测序，经质控后获得54103个细胞，共分为9种细胞类型。9种细胞类型在5例患者的肿瘤和癌旁组织中都有，但每种主要细胞类型的浸润性程度不同，可能反映了结直肠癌进展阶段的差异。
2. Characteristics of cell populations in tumor tissues from CRC patients reveals hallmark signatures of TME and prediction of clinical outcome.
Fig 2a：随后作者探究了这些细胞亚群相关调控通路基因的表达情况。作者使MsigDB数据库中的hallmark基因集来分析肿瘤组织和邻近正常组织之间细胞通路的变化。结果显示与正常组织相比，肿瘤组织中的免疫相关途径，包括炎症反应、IL2/STAT5信号和IL6/JAK/STAT3信号，不仅在免疫细胞群（(如髓系细胞和T/ILC细胞）中富集，在MSC和ECs在肿瘤组织中也富集，提示MSCs和ECs也参与抵抗结直肠癌的免疫反应。
与正常样本相比，肿瘤的MSC、ECs和髓系细胞中缺氧的标志基因集更丰富。这些特征可能反映了肿瘤缺氧区域基质细胞的相互作用，将巨噬细胞、MSC和ECs连接起来，重塑CRC微环境。
做法参考分组水平GSVA和批量GSEA和GSVA分析，把热图画成气泡图就行了。
由于单细胞样本数有限，作者纳入了14个数据集，包括TCGA中的 COAD and READ 队列和GEO中12个独立的CRC队列。随后作者使用CIBERSORT用自己的单细胞数据对这14个数据集进行了反卷积。
Fig 2b：反卷积之后作者做了不同细胞类型比例相关性，发现不同数据集中Myeloid cell和MSCs (间充质基质细胞) 都存在100%的正相关。
这个思路好哎⚠️
Fig 2c：14个数据集的Myeloid cell和MSCs相关性展示。
Fig 2d：并且作者还发现MSC浸润程度较高的CRC患者与较差的overall survival (OS)和progression-free survival (PFS)相关，髓系细胞浸润程度高同样与较差的OS和PFS相关。
3. Tumor-specific FAP+ fibroblasts are associated with colorectal cancer progression.
Fig 3a-c：MSCs和成纤维细胞样细胞被认为是调节肿瘤发生和癌症进展的关键基质细胞类型。结合前面发现的MSCs与不良预后相关，作者对MSC进行了亚群细分，得到10个亚型。其中FAP+成纤维细胞在肿瘤组织中显著升高。(FAP是活化成纤维细胞的marker，参考CAR T cells produced in vivo to treat cardiac injury)
Fig 3d, e：公共数据集也显示肿瘤样本的FAP+成纤维细胞显著升高，且与较差的PFS相关。
Fig 3f, g：随后作者结合了每个细胞群的高表达基因，使用流式对前面的结果进行了验证，验证了肿瘤组织中FAP+成纤维细胞的显著升高。
Fig 3h：随后作者使用velocity探究了FAP+成纤维细胞的来源，发现它主要由FGFR2+ fibroblasts 或 ICAM1+ telocytes分化而来。
Fig 3i-l：随后作者使用SCENIC对MSCs进行了转录因子预测，发现FAP+成纤维细胞主要受TWIST1等的调控。
Fig 3m：Hif1a通路在FAP+成纤维细胞中也存在显著激活。
4. Tumor-specific SPP1+ macrophages are associated with CRC progression.
和Fig3的分析思路一模一样
作者对髓系细胞进行了细分，得到9种亚型。比例变化结果显示巨噬细胞和中性粒细胞主要存在于肿瘤组织中，而DC在相邻正常组织中富集。
值得注意的是，SPP1+巨噬细胞是肿瘤特异性巨噬细胞，占肿瘤样本中髓系细胞的11.6%，但仅占相邻正常组织中髓样细胞的0.68%。
TCGA和GSE17536CRC队列中，SSP1+巨噬细胞高浸润患者具有更短的PFS。分化轨迹结果表明肿瘤特异性SPP1+巨噬细胞可能起源于THBS1+巨噬细胞。调节因子分析结果表示SPP1+巨噬细胞主要受到STAT1的调节。
此外，SPP1+巨噬细胞也受到HIF-1信号通路的调节 (Supplementary Fig. 6h, i)。由于FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞都与缺氧诱导的通路密切相关，作者推测在肿瘤的缺氧区域可能存在一个基质细胞介导的网络，该网络将巨噬细胞和MSC连接起来，共同促进CRC微环境的恶化。
5. High infiltration of FAP+ fibroblasts and SPP1+ macrophages correlates with worse patient survival.
Fig 5a：作者利用CIBERSORTx在14个独立的CRC队列中分析scRNA-seq鉴定到的58个细胞类型的浸润状态，结果验证FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞相关性最高。（和Fig2a的区别是那个做的是细胞大群的相关性，这里做的是所有细胞亚群的相关性。）
Fig 5b：在FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞不同浸润水平的患者中，二者浸润均较高的患者(FAP+High_SPP1+High)PFS最短，提示这两种细胞类型可以协同促进肿瘤进展。
Fig 5c：与FAP+Low_SPP1+Low相比，FAP+High_SPP1+High样本显著富集到内皮间质转化、缺氧、TNF-a和IL-6信号通路。
Fig 5d-e：肿瘤样本的FAP和SPP1表达均增加。
Fig 5f-h：SPP1和FAP的高表达均与较差的OS和PFS相关。
Fig 5i-j：免疫荧光结果显示肿瘤组织中FAP和SPP1的表达均特异性增加。且CRC组织中SPP1阳性和FAP阳性细胞细胞在空间上非常接近，提示二者之间可能存在相互作用。
6. Cell–cell interaction of FAP+ fibroblasts and SPP1+ macrophages revealed by spatial transcriptomics.
为了得到更多的空间信息，作者对五例检测了单细胞的患者中的四例的肿瘤组织进行了空间转录组测序。
Fig 6a-c是Patient6的组织，聚类得到10个cluster。Fig 6a-c是Patient7的组织，聚类得到6个cluster (P8和P7一样是6个cluster)。P9聚类得到8个cluster(Supplementary Fig. 9d–f)。
Fig 6a-k：结果显示大多数FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞存在共定位，并包裹恶性上皮细胞(i)。
Fig 6l：FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞中促结缔组织增生结构形成的途径高度活跃，包括细胞外基质组织、胶原纤维组织和对TGF-β的反应。这些现象表明这两种类型细胞之间可能存在物理相互作用，并可能调节促结缔组织增生的微环境以限制免疫细胞浸润至肿瘤核心。
Fig 6m：T细胞和B细胞被排斥在肿瘤区域以外。
7. FAP+ fibroblasts and SPP1+ macrophages interaction may contribute to desmoplastic tumor microenvironment.
为了探究CRC患者中FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞互作时的关键调控分子，作者使用NicheNet探究了FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞之间的机制。
Fig 7a：作者发现FAP+成纤维细胞可以通过COL1A1/LAMA1- ITGB1受体配体对和SPP1+巨噬细胞相互作用。此外，FAP+成纤维细胞通过TGF-β超家族基因TGFB1和INHBA的表达来增强SPP1+巨噬细胞的促炎活性，TGF-β可以诱导SPP1+巨噬细胞中ACVRL1、ACVR1或ACVR1B的表达。
FAP+成纤维细胞还可以通过WNTSA-FZD2和CCL3-CCR5互作增强SPP1+巨噬细胞的招募。此外，FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞还可以通过RARRES2-CMKLR1进行互作。
Fig 7b, c：RARRES2在FAP+成纤维细胞中高表达，而CMKLR1(编码chemerin的受体) 在SPP1+巨噬细胞和THBS1+巨噬细胞中都存在高表达。前面velocity的结果提示THBS1+巨噬细胞可能是SPP1+巨噬细胞的来源，因此RARRES2-CMKLR1可能驱动THBS1+巨噬细胞向SPP1+巨噬细胞分化。
Fig 7d：CRC患者的chemerin高于正常对照。
Fig 7e-h：NicheNet的结果显示，SPP1+巨噬细胞高表达细胞因子TGFB1、IL1A和IL1B，可与FAP+成纤维细胞表达的受体结合，促使多种编码胶原和基质金属蛋白酶基因靶点的表达。
Fig 7i：对targets的KEGG通路富集结果显示这些靶点参与多种促炎和ECM增生通路。
Fig 7j：最后作者构建了top3的ligand（TGFB1, IL1B, IL1A）和ECM-related targets的互作网络，发现了40个下游regulators, 包括HIF1A, AKT1, STAT1 和 NFKB1。这些靶点是促结缔组织增生反应的重要组成部分，其中大部分参与ECM通路。
综上，FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞形成一个相互作用的网络，支持彼此的维持和功能。这两种细胞类型可能在ECM重塑中发挥重要作用，可能促进TME促纤维增生区的形成。
8. High infiltration of FAP+ fibroblasts and SPP1+ macrophages correlates with immunotherapy resistance.
最后作者分析了具有不同FAP+成纤维细胞和/或SPP1+巨噬细胞浸润模式的肿瘤的局部免疫特征。
结果显示FAP+High_SPP1+High的肿瘤样本表现相对高比例的非同义突变和单核苷酸变异（SNV) 预测的新生抗原，并且具有较高的香农嫡指数和TCR丰富度，说明T细胞对新抗原的无效反应。
在所有CRC亚型中，该亚型的淋巴细胞浸润最低，表明该特定类型肿瘤的微环境特征是免疫排斥型的。
采用IMvigor210公共数据集分析预后相关性发现，FAP或SPP1表达水平高的患者以及FAP和SPP1表达都高的患者具有更短的OS。相比FAP+Low_SPP1+Low的患者，FAP或SPP1High的患者表现出较低的应答，和更多的疾病进展(PD)，这表明FAP或SPP1高表达的患者对抗PD-L1治疗的应答明显低于其他患者。
FAP或SPP1表达水平高的患者以及FAP和SPP1表达都高的患者具有更短的OS。相比FAP和SPP1低表达的患者，FAP或SPP1高表达的患者表现出较低的应答，和更多的疾病进展(PD),SPP1高表达的患者对抗PD-L1治疗的应答明显低于其他患者。
模式图
1.研究团队通过整合分析scRNA-seq数据、公开发表的scRNA-seq和bulkRNA-seq数据集、空间转录组数据、FACS、IF和免疫治疗的转录组数据，本研究提供了单细胞分辨率下的配对的肿瘤和癌旁正常组织综合的TME景观图。
2.与癌旁组织相比，结直肠癌组织特异性富集FAP+fibroblasts及SPP1+macrophages，并通过CIBERSORTx对多个结肠癌数据集分析发现这两种细胞浸润程度高度相关。
3.研究团队进一步使用空间转录组发现存在同时表达这两种细胞特征基因的聚类，这一聚类的空间位置和细胞外基质的形成高度相关，提示FAP+fibroblasts和SPP1+macrophages在肠癌中的空间定位上也接近，并围绕肿瘤中心形成"墙壁"样的肿瘤边界。
4.最终证实FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞的相互作用参与形成促结缔组织增生性TME，阻止淋巴细胞浸润，可能导致肿瘤免疫治疗抵抗，可以作为CRC治疗的潜在靶点。
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