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本文属于单肿瘤分型思路，类似的分型文章我们也解读过很多。
肿瘤分型文章比较重要的结论就是分型之间生存分析有差异，构建的评分能够预测预后，免疫治疗疗效。我们可以通过使用不同的数据集或者使用不同的基因集进行分型，以确保得到的结果与肿瘤预后或免疫治疗疗效相关。如果想做类似的分析，可以联系小编咨询。
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研究背景：
结直肠癌(CRC)是美国第三大常见癌症，也是第二大死亡原因。在癌症分类、预后预测和治疗中，肿瘤、淋巴结、转移(TNM)分期被频繁使用。然而，TNM分期实际上是不够的。
肿瘤微环境(TME)在肿瘤的形成过程中起着重要的作用。TME包含多种细胞类型，包括浸润性免疫细胞、肿瘤相关成纤维细胞、血管细胞等。这些细胞类型相互关系，可以控制肿瘤细胞增殖、细胞死亡和免疫逃避等功能。肿瘤发生的所有阶段都受到TME内部炎症的影响，炎症可以在很大程度上驱动TME内肿瘤细胞和周围细胞的可塑性。目前还没有可靠的基于炎症相关基因的模型来预测结肠癌患者预后的方法。
研究流程图：
研究结果：
一、差异炎症相关基因的鉴定及生物学功能分析
1、根据GeneCards数据库，获得357个炎症相关基因。通过对COAD和正常结肠组织的差异分析，获得了66个上调基因和54个下调基因(图1A，B)。
2、GO和KEGG通路富集分析显示，上述差异表达的基因主要富集在免疫、炎症、细胞因子-细胞因子受体和肿瘤相关的生物学功能和信号通路中(图1C，D)。
3、排名前10个上调和下调基因之间的相关性(图1E)，并构建PPI网络，使用Cytoscape进行可视化(图1F)。筛选出排名前十位的枢纽基因(图1G)，根据MCODE鉴定出两个模块(图1H、I)。
二、炎症相关簇的识别和集群与肿瘤免疫微环境、肿瘤发生评分和TSI之间的相关性分析。
1、通过单因素Cox分析，获得了10个与预后相关的基因，其中IL13是保护因素，其他9个基因为危险因素(图2A)。相关分析显示，大部分基因之间存在相关性(图2B)。
2、当COAD患者聚类为两个亚组时，聚类效果最好，亚组内部一致性和稳定性较好(图2C-E)。
3、生存分析显示，集群1的预后优于集群2(图2F)。
4、热图显示了两个聚类之间的基因表达差异，并与分期、T分期、N分期等临床病理参数显著相关(图2G)。
5、分析两个聚类之间免疫浸润的差异，发现这两个集群之间的免疫细胞和免疫相关功能或通路存在显著差异。聚类2与更多的免疫细胞浸润相关 (图2H)。并且聚类2具有更高的免疫评分、基质评分、最终评分和较低的肿瘤纯度(图2I)。此外，聚类2与许多MHC分子的高表达有关(图2J)。
6、在集群2中，血管生成活性、间充质EMT、致瘤细胞因子和干性评分显著升高(图2K)。7、由于这两个集群在免疫浸润方面存在显著差异，故评估了与5个常见免疫检查点的相关性。集群2中PD-L1、CTLA4、HAVCR2、LAG3和PD1的表达量较高(图2L)。集群2与较高的TIDE评分相关(图2M)。
三、构建一个与炎症相关的标签和基于该标签的列线图
1、利用多因子Cox回归分析选取了4个基因进行签名(图3A)。签名中每个基因的系数如图3B所示。
2、图3C显示了风险评分与PLCG2、TIMP1、BDNF和IL13的相关性。风险评分与T期和N期相关（图3D）。高危评分的患者预后较低风险评分的患者差，一年后该标签的AUC为0.671(图3E)。使用GSE17538数据集对标签进行验证，具有良好的效率(图3F)。
3、通过单因素和多因素Cox回归分析，该标签是一个独立的危险因素(图3G，H)。基于上述多变量Cox回归分析的结果，我们在构建列线图时加入了年龄和标签，其中标签是列线图中最重要的因素(图3M)。校准图显示，实际的3.5年、5年和7.5年的生存时间与预测的生存时间高度一致(图3N)。
四、根据特征预估肿瘤免疫细胞浸润和免疫检查点抑制剂
1、GSEA研究结果显示，高危组中多个经典肿瘤相关通路富集，癌症通路显著富集(图4A)。JAK-STAT信号通路是最相关的KEGG通路 (图4B)。
2、通过GSEA发现了许多免疫相关通路与高危组相关(图4C)。
3、通过ssGSEA算法，高危组比低危组具有更高的免疫细胞浸润和更多的免疫相关功能或通路(图4D)。对上述结果进行检查，发现高危组的免疫评分、间质评分、估计估计评分较高，肿瘤纯度较低(图4E)。
4、高危组中以浸润为主的免疫细胞包括B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞(图4F)。高危组的嗜酸性粒细胞含量也较高(图4G)。此外，MHC分子在高危组中显著增加(图4H)。5种免疫检查点抑制剂(PD-L1、CTLA4、HAVCR2、LAG3和PD1)在高危组中高表达(图4I)。高危组也与较高的TIDE评分相关(图4J)。
五、血管生成活性、间充质EMT、致瘤细胞因子、干性评分和tsi与特征的相关性。
1、GSEA结果显示，在高危组中，血管生成、上皮-间充质转化、细胞因子-细胞因子受体相互作用均富集(图5A)。
2、图5B显示，高危组具有较高的间充质EMT、致瘤细胞因子和干性评分。图5C显示了风险评分与4项指标的相关性，表明风险评分与间充质EMT评分、致瘤细胞因子评分和干性评分呈正相关。此外，高危组有较低的TSI，如mRNAsi、EREG-mRNAsi、mDNAsi、EREG-mDNAsi和ENHsi(图5D)
六、体细胞突变与TMB特征的比较
1、为了比较高风险组和低风险组之间基因组突变的差异，从TCGA下载了简单的核苷酸变异数据。APC（70%）、TTN（54%）、TP53（50%）、KRAS（42%）和SYNE1（33%）突变频率最高，APC（78%）、TP53（57%）、TTN（44%）、（43%）PIK3CA（27%）是低风险组的前5个基因(图6A、B)。
2、大多数基因之间同时存在基因突变，在高危组中发现了互斥的APC-RYR2突变(图6C)。在低风险组中也经常发生基因突变并发现象(图6D)。
3、对两组间的TMB进行比较，发现差异无统计学意义(图6E)。高TMB组和低TMB组之间的生存时间没有差异(图6F) 。在我们的模型中，高危+高TMB组的预后明显低于低危+低TMB组(图6G)。最后，我们检测了标签中的4个基因的突变率，发现突变率都很低(图6H)
七、化疗反应的预测及小分子药物的筛选
1、采用GDSC方法预测两组间常用化疗药物的化疗反应(图7A)。
2、通过比较低危组和高危组，分别获得了501个上调基因和12个下调基因(图7B)。根据差异表达基因，筛选出6种最相关的小分子药物作为COAD患者的潜在靶标候选药物。通过PubChem数据库显示了甲酸酯、金刚烷胺、环丙沙星、齐多夫星、匹美西林和辛切宁的三维结构(图7C)。
八、PLCG2、TIMP1、BDNF、IL13在不同结肠癌细胞系中的表达
qRT-PCR检测显示，结肠癌细胞中TIMP1和BDNF的mRNA表达水平显著高于NCM460细胞(图8A，B)。除HT29和RKO外，HCT116、SW480、LOVO和DLD-1细胞中IL13的mRNA水平显著升高(图8C)。根据数据库分析，PLCG2在肿瘤组织中低表达，实验结果证实了这一结论(图8D)。
总结：本研究确定了结肠癌中基于IRGs的分子亚型，并使用IRGs来构建一个预后特征。分析了不同分子亚型之间和不同危险组之间的免疫微环境、基因突变状态和药物敏感性。该标签可为临床判断预后和药物治疗提供依据。
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