摘要

百合以其优雅的外观和迷人的香味成为世界上最重要的经济花卉(huì)之一，主要由单萜罗勒烯(xī)、芳樟(zhāng)醇和苯类化合物组成。糖是植物的主要产物，果糖和己糖是植物中大多数有机化合物和代谢途径的底物。在此，我们从‘西伯利亚’百合花中分离并表征己糖激酶（LoHXK）和果糖激酶（LoFRK）的功能，这表明它们在花香产生中的潜在作用。实时荧光定量PCR结果表明LoHXK和LoFRK在花丝中高表达。过表达和病毒诱导的基因沉默（VIGS）分析表明，LoHXK和LoFRK通过调节关键结构挥发性合成基因（LoTPS1和LoTPS3）的表达显著改变了β-罗勒烯和芳樟醇含量的排放。在外源葡萄糖和果糖作用下，β-罗勒烯和芳樟醇增加，关键结构基因的表达水平上调，β-罗勒烯和芳樟醇的排放遵循昼夜节律。通过13C标记的葡萄糖和13C标记的果糖实验测定碳通量表明，罗勒烯和芳樟醇的质谱显著增加，但是，苯甲酸乙酯的m/z比没有变化。此外，酵母双杂交(Y2H）和双分子荧光互补(BiFC）测定结果表明LoFRK与LoMYB1和LoMYB2蛋白相互作用。总之，这些结果表明己糖激酶和果糖激酶可能在调节‘西伯利亚’百合罗勒烯和芳樟醇的生物合成中发挥重要作用。

原文链接Putative regulatory role of hexokinase and fructokinase in terpenoid aroma biosynthesis in Lilium ‘Siberia’

1. 介绍

花香是开花植物的一个重要特征，在植物生命活动中起着许多关键作用，尤其是在吸引传粉者，抵御病原体和食草动物方面。花香是开花植物和传粉者之间重要的交流途径，尤其是在长距离信号传递中，并且是吸引传粉者的化学信号。花香通过对微生物和食草动物害虫产生威慑或毒性作用，并最大限度地减少氧化应激和热应激造成的损害，在植物抵御生物和非生物胁迫方面也发挥着至关重要的作用。花香不仅对提高观赏植物的审美价值很重要，而且对制药、食品和化妆品行业也必不可少。

糖在植物生长和发育、开花、顶端优势以及抵御外部刺激方面发挥着至关重要的作用，因为它们是碳骨架、渗透保护剂和几种防御反应调节途径中的信号分子的供体，遗传分析揭示了植物激素信号与糖之间的相互作用。果糖激酶(FRK)和己糖激酶(HXK)是唯一的果糖和已发现的葡萄糖磷酸化酶，参与植物中几种有机代谢的途径。

在植物中，己糖（葡萄糖和果糖）大量产生，是自然界有机物的主要来源。HXK在己糖的磷酸化中起核心作用。己糖激酶还在通过信号传感和转导机制调节植物糖代谢中发挥重要作用，这些机制调节响应外部刺激的几个基因的表达。HXK1蛋白在不同的生理过程中具有多种功能，例如花粉萌发和花药裂开。红花烟草HXK1和AtHXK1具有双重功能活性，介导糖感应和己糖磷酸化。此外，它们还在程序化细胞死亡、萌发、气孔关闭和对环境刺激的反应。在葡萄中，HXK在蔗糖合酶（SuSy）和细胞壁转化酶（CWINV）的调节中起重要作用。外源性葡萄糖(Glc)应用通过增加拟南芥信号传导和ABA合成基因的表达，使其内源性ABA水平升高。HXK亚细胞定位结果表明，它们分布在线粒体、细胞质、质体基质和叶绿体中。HXK基因已在各种植物中得到鉴定，但HXK在‘西伯利亚’百合中的作用仍有待阐明。

果糖激酶（FRK）是植物中主要的果糖磷酸化酶。在植物和细菌中，FRKs将果糖（Fru）磷酸化为6-磷酸果糖（F6P），而哺乳动物FRKs将果糖磷酸化为1-磷酸果糖（F1P）。FRK已从许多其他植物物种中分离和表征，包括番茄、拟南芥、马铃薯、水稻、甜菜、豌豆、大麦、玉米、菠菜、和鳄梨。其中，来自番茄的FRKs在功能和生化方面得到了很好的表征。在番茄中，SlFRK1和SlFRK2促进开花并在根和茎生长以及种子发育中发挥重要作用。在拟南芥的根和地上部，已经鉴定出两种FRK基因的丰富表达，但是编码这些活动的基因功能尚不清楚。在杂交白杨（Populus tremula x tremuloides）中，FRK2在形成木质纤维素的碳通量中起着至关重要的作用。上述数据表明，果糖激酶在植物生命活动中起着重要作用，并且可以作为果糖受体来调节植物的开花和结果。

‘西伯利亚’百合（东方杂种）是百合科多年生草本植物，由于其大而雪白、芳香的花组织在全球花卉市场上占有突出地位，是研究花香的极好资源。萼(è)片和花瓣是花香散发的关键来源，其发生在与传粉者活动一致的昼夜节律中。萜类化合物和苯类化合物，如罗勒烯、芳樟醇、月桂烯、苯甲酸甲酯和苯甲酸乙酯在花香中含量丰富，但是，目前还没有关于植物挥发物产生的转录调控机制的信息。在百合转录组中共鉴定出15个LoFRK和6个LoHXK基因。在此处，我们揭示了果糖激酶和己糖激酶在‘西伯利亚’百合花香味产生中的催化和调节作用。

2. 材料与方法

2.1 植物材料和生长条件

‘西伯利亚’百合和拟南芥在以下条件下，在生长室中生长：26±2℃，65–80%相对湿度和12/12小时光/暗循环。为了分析组织特异性表达模式，将花发育过程（芽期到衰老）分为五个阶段，如图3c所示（D1：芽；D2：部分开放；D3：半开花；D4：盛开；D5：衰老）。

2.2 外源性葡萄糖和果糖处理

对于葡萄糖和果糖的处理，在芽期选择花（图3）并在上述条件下放置在培养箱中。葡萄糖和果糖溶液（6%）用无菌水制备，将花蕾期的花放入盛有葡萄糖和果糖溶液的烧杯中，在盛开阶段通过GC-MS进行花卉挥发性分析。13C标记的果糖、葡萄糖和其他化学品购自Sigma-Aldrich(MO,美国）。13C标记的果糖和葡萄糖的处也采用了类似的方法。为了评估花挥发物的昼夜节律模式，在上述温度条件下，将花保持在完全黑暗的环境中。

2.3 LoHXK和LoFRK的生物信息学分析和克隆

从‘西伯利亚’百合转录组数据（未发表）中，基于基因本体（GO）术语分析确定了LoXHK和LoFRK。LoXHK和LoFRK的直系同源物是通过NCBI中的BLAST程序以默认参数识别的。LoXHK和LoFRK与从不同物种鉴定的其他HXK和FRK的多序列比对(MSA)使用CLUSTALX进行系统发育树是使用MEGA7中的比对序列通过具有1000次引导复制的邻居连接(NJ)方法构建的。LoHXK和LoFRK的开放阅读框按照制造商的说明克隆到载体pMD19-T（TaKaRa）中，然后通过测序确认，正向和反向引物列在补充表1中。

2.4 RNA分离、cDNA转化和qRT-PCR分析

从不同器官中分离总RNA以评估LoHXK和LoFR的组织特异性表达模式分析（图3a和b）。为了评估昼夜节律，在开花后以8小时的间隔收集样品。第一个样本是在早上(8:00)和下午(16:00)和深夜(24:00)分别采集的。使用HiPure植物RNA迷你试剂盒(Magen)按照制造商的指南提取不同组织的总RNA。根据制造商的指南，使用PrimeScript™ RT 试剂盒(TaKaRa)获得cDNA。参考基因的克隆如前所述（Abbas等，2020a）。按照制造商的说明，在ABI 7500快速实时PCR系统（美国应用生物系统公司）中使用iTaqTM Universal SYBR® Green Supermix 以20 μL的总体积进行定量实时PCR。PCR条件遵循先前描述的条件。验证引物的特异性通过标准曲线和熔解曲线。基因的相对表达水平通过2-ΔΔCt方法，使用GAPDH作为参考基因。实验一式三份进行并进行统计学分析。引物列于补充表1中。

2.5 亚细胞定位分析

LoHXK和LoFRK的N端序列（1 bp到120 bp）使用不同的预测服务器进行分析，例如Predotar (http://urgi.versailles.inra.fr/predotar),WoLF PSORT (http://wolfpsort.seq.cbrc.jp/) 和TargetP (http://www.cbs.dtu.dk/services/ ）。使用Spe I和Sac I作为限制性位点，将两个基因的开放阅读框(ORF)克隆到载体p35S-GFP中，然后进行测序以确认正确插入到载体中。拟南芥原生质体的分离和转化如前所述（Yoo等，2007）。融合构建体CaMv35S-NLS-mCherry（具有核定位信号）和CaMv35S-COX11-mCherry分别用作核和线粒体中的定位标记。这两个载体（Addgene质粒#108881）由华南农业大学植物遗传学国家重点实验室提供。之后，转化体原生质体在黑暗中孵育14-16小时，然后使用如前所述的共聚焦激光扫描显微镜进行可视化，列出了引物在补充表1中。

2.6 酵母双杂交试验(Y2H)

LoFRK或LoHXK的ORF被克隆到载体pGADT7 (AD)中，而LoMYB1、LoMYB2和LoMYB3序列被连接到载体pGBKT7 (BD)中，然后将构建体转化为酵母菌株Y2H Gold，遵循制造商的协议作为之前解释过（Abbas等，2021）。空的AD用作对照，通过酵母细胞在SD平板(SD/-Leu-Trp-His-Ade)上的生长证实了转化体的活性，引物列在补充表1中。

2.7 双分子荧光互补(BiFC)测定

LoFRK、LoMYB1和LoMYB2的全长序列被独立克隆到载体pUC-SPYNE和pUC-SPYCE中以生成LoFRK-YFPN、LoMYB1-YFPC和LoMYB2-YFPC结构。以空载体作为对照，然后将重组质粒和对照质粒转移到EHA105细胞中，离心后收集农杆菌溶液，悬浮在含有0.1 M 2-(4-吗啉)、乙磺酸和0.1 M乙酰丁香酮的0.1 MMgCl2中，并以1:1的比例混合1.5小时。洋葱表皮浸泡在农杆菌液中25分钟。吸干液体表面后，转移至1/2 MS固体培养基中在25℃下放置孵育3天。在Leica DM RXA2下观察细胞如前所述（Ke等人，2019年）。

2.8 病毒诱导的基因沉默

使用大麦条纹花叶病毒(BSMV)系统进行病毒诱导的基因沉默。LoFRK的810 bp至999 bp片段和LoHXK序列的1312 bp至1503 bp片段使用Apa I酶作为限制位点将序列插入pCaBS-γ载体以生成pCaBSγ:LoFRK和pCaBSγ:LoHXK构建体，用于抑制LoFRK和LoHXK。接下来，构造被转化进入根癌农杆菌菌株EHA105，随后如先前解释的那样共渗入‘西伯利亚’百合花中。如前所述，使用GC-MS系统在盛花期进行完整的花挥发性分析，并且该实验一式三份进行。

2.9 LoFRK和LoHXK在‘西伯利亚’百合花中的过表达

含有卡那霉素和25 μg/mL利福平的新鲜液体培养基在28℃下振荡过夜。收集细菌并以0.6的OD600重悬在含有100 μM AS 的MS液体培养基中。过表达载体构建与农杆菌如上所述进行根癌土壤杆菌浸润过程。

2.10 花卉挥发物的顶空分析

花挥发物分析是将一朵花放入以癸酸乙酯为内标的2 L玻璃瓶中，并用铝片覆盖30min，然后将聚二甲基硅氧烷(PDMS)纤维注入玻璃瓶中以进行花香挥发分析。陷害挥发物30分钟，此后，将PDMS注入GC-MS系统（安捷伦），如前所述（Abbas等人，2019），并且样品立即在液氮中冷冻并储存在-80℃。挥发性化合物通过与质谱、保留时间和可靠标准的比较来鉴定为之前提到过（Abbas等，2019）。

2.11 可溶性糖的提取

样品用液氮研磨成粉末，使用75%预冷甲醇提取0.1 g样品三次，添加核糖醇作为内标。以2000 g离心10分钟后，将上清液转移到10 mL 圆形小心去除底部离心管中的杂质，然后加入氯仿和无菌水，2200×g离心15分钟。接下来，将溶液通过0.2 μM的水-可湿性聚四氟乙烯(WWPTFE)膜并浓缩。接下来，可溶性糖类依次用甲氧基胺盐酸盐和N-甲基-N-三甲基甲硅烷基-三氟乙酰胺(MSTFA)进行提取和衍生化。最后，如前所述，使用GC-MS系统（安捷伦）评估代谢物。

3. 实验结果

3.1 LoHXK和LoFRK的克隆和表征

己糖激酶和果糖激酶基因是使用先前描述的百合转录组unigenes鉴定的（Abbas等，2019, 2021）。根据花中的最高表达，选择LoFRK和LoHXK进行进一步分析。LoFRK和LoHXK的序列使用‘西伯利亚’百合的cDNA通过PCR分析和扩增如前所述（Abbas等，2019）。LoHXK和LoFRK的编码序列包括一个1503和999 b 的开放阅读框(ORF)，编码500和336个氨基酸残基，分子量分别为54和35.7 kDa，等电点(pI)分别为4.99和5.02。为了分析LoHXK和LoFRK与其他各种植物FRK和HXK蛋白的系统发育关系，利用临近法（NJ）建立一个无根树。所有HXK蛋白分为3个不同的组，称为G I-GIII（图1a）。类似地，FRK蛋白分为4个不同的进化枝，称为G I-G IV（图1b）。LoHXK与AtHXK1 (66.73%)和AtHXK2 (66.2%) 显示出高氨基酸序列相似性，LoFRK与BvFRK (55%) 一样高度相似。

此外，多序列比对分析表明，这两个氨基酸序列均由HXK和FRK蛋白的高度保守特征基序界定，LoHXK包括高度保守的四环肽结合结构域，这对于己糖激酶作为糖感应蛋白参与植物的各种调节途径是必不可少的（图1c）。同样，LoFRK在序列的N和C端以及ATP和糖结合域的N和C端保持保守的GG和GACD基序，这是pfkB碳水化合物激酶家族的特征（图1d），表明FRK基因随着进化是高度保守的。

图1.  LoHXK和LoFRK的生信分析结果

3.2 LoHXK和LoFRK的表达分析

为了研究LoHXK和LoFRK在‘西伯利亚’百合不同组织和花发育阶段的表达模式，进行了定量RT-PCR分析。结果表明LoHXK在花药中的表达最高，其次是花瓣、根和茎组织。同样，LoFRK的mRNA在花药中表达最高，其次是根、茎、雌蕊、叶和花瓣组织（图2a）。此外，在萼片中几乎检测不到这两种基因的mRNA（图3）。对于花发育阶段，LoHXK的表达水平在芽期（D1）最低，达到峰值在开花阶段（D2-D4），然后在衰老中下降阶段(D5)（图2和3）。相比之下，LoFRK的表达水平在‘西伯利亚’百合花的衰老阶段最高，在芽和开花阶段相对较低（图2b）。

图2.  LoHXK和LoFRK的表达分析 图3. 定量分析对应的组织示意图

3.3 外源性葡萄糖和果糖应用

我们之前的研究表明，‘西伯利亚’百合花挥发物的排放以昼夜模式发生（Abbas等，2019）。在这里，我们以相同的时间间隔测量了‘西伯利亚’百合花中Glc、Fru和蔗糖(Suc)的内源含量。数据显示Fru含量最高，其次是Glc和Suc（图4a）。有趣的是，综上所述，内源性含量与我们之前研究报道的花香散发的昼夜模式一致，即本研究中Glc、Fru和Suc的内源性含量也在下午（16:00）达到峰值，其次是上午（8:00）和深夜（24:00），表明与花香散发模式有关。为了验证这种联系，我们将Glc和Fru处理应用于花朵和评估了主要花卉挥发物的同时排放水平。在Glc和Fru处理下，罗勒烯的排放水平相对于对照花显著增加，并遵循上述相同的昼夜节律模式。Glc处理的花中罗勒烯的排放水平高于Fru处理的花（图 4b）。同样，在Glc和Fru处理下，芳樟醇的排放水平高于对照，并遵循上述昼夜节律模式。此外，Glc处理的花中芳樟醇的浓度高于Fru处理的花（图4c）。有趣的是，相对于对照，苯甲酸乙酯的释放不遵循昼夜节律模式并且在Glc和Fru处理的花中减少（图 4d）。

为了进一步验证上述数据，从用Glc和Fru处理的‘西伯利亚’百合花中获得总RNA，并进行定量RT-PCR。Glc处理的花中关键结构挥发性合成基因(LoTPS1/3)和LoHXK的转录水平升高，而挥发性合成基因也随昼夜节律表达模式（图4e）。类似地，与对照相比，经Fru处理的花中LoTPS1/3和LoRFK的mRNA转录水平高度升高，并遵循上述昼夜节律表达模式（图4f）。值得注意的是，LoTPS1的转录水平在Glc处理的花中最高，而LoTPS3的表达水平在Fru处理的花中最高。这些结果表明Glc和Fru在花挥发物的释放通过调节挥发性结构基因的表达中起关键作用。

图4. 外源果糖与葡萄糖处理实验结果

3.4 葡萄糖和果糖的同位素标记

稳定同位素标记是一种有价值的工具，已被广泛用于代谢物的鉴定和定量。验证Glc和Fru的参与作为百合花香味产生的底物，用无菌水（对照）、13C-标记的Glc和13C-标记的Fru处理花朵，然后使用之前描述的GC-MS进行分析（Abbas等，2019，2020a）。结果表明，花香成分（整体香味混合物中每种挥发物的特性和散发率）保持不变然而，解链后，罗勒烯和芳樟醇的质谱在13C标记的Glc和13C标记的Fru处理后发生了显著变化（图5；补充图1）。这些发现表明Glc和Fru在作为底物的罗勒烯和芳樟醇的合成中发挥了关键作用。有趣的是，苯甲酸乙酯的m/z比没有变化，间接表明Glc和Fru仅进入MVA和MEP途径。

图5.  葡萄糖和果糖的同位素标记检测结果

3.5 抑制LoHXK和LoFRK的表达

为了更好地了解LoHXK和LoFRK在花香生物合成途径中的潜在作用，病毒诱导的基因沉默(VIGS)在LoHXK和LoFRK沉默的花，关键结构挥发性生物合成基因的mRNA水平被下调。在LoHXK沉默的花中，LoTPS1、LoTPS3、LoMYB1和LoMYB3的mRNA转录水平相对于对照分别下调了79.7%、86.7%、75%和44%（图6c）。类似地，与对照相比，LoFRK的沉默使LoTPS1、LoTPS3、LoMYB1和LoMYB3的mRNA转录水平分别下调高达70%、79%、39%和78%（图6c）。

LoHXK和LoFRK沉默对花挥发物含量的影响表明，与对照相比，LoHXK沉默的花中罗勒烯和芳樟醇的浓度分别降低了26%和37.4%，而LoFRK沉默的花中的罗勒烯和芳樟醇浓度分别下降了67.5%和75.5%（图6d）。相反，乙基苯的挥发物含量没有观察到显著变化。因此，结果表明LoHXK和LoFRK在‘西伯利亚’百合的萜类香气生物合成中起关键作用。

图6.  抑制LoHXK和LoFRK的表达定量结果

3.6 LoHXK和LoFRK的过表达

为了确定LoHXK和LoFRK在调节萜类生物合成中的功能，这两个基因在百合中过表达LoFRK过表达的花中，与对照相比，LoHXK和LoFRK的活性分别增加了67.1%和47.2%，而且，与对照相比，LoFRK过量表达的花中的奥辛烯和芳樟醇的释放量分别增加了72.6% 和84%（图7d）。类似地，相对于对照，在LoHXK过表达的花中，罗勒烯和芳樟醇的排放水平分别显著增加了17%和13.3%（图7d）。正如预期的那样，苯甲酸乙酯的含量没有显著变化。

为了进一步验证上述发现，从LoHXK和LoFRK过度表达的‘西伯利亚’百合花中提取总RNA，并进行qRT-PCR以检查相关转录水平。与上述发现一致，在LoFRK和LoHXK过表达中观察到LoTPS1/3和MYB1/2转录本显著增加，表明LoFRK和LoHXK正调节‘西伯利亚’百合萜烯合酶基因（LoTPS1和LoTPS3）的表达。LoTPS1/3和LoMYB1/2的mRNA转录水平分别增加了99.4%、85.8%、103%和14.3%。LoFRK过表达的花，相对于对照（图7c）。在LoHXK过表达的花中，LoTPS1/3和LoMYB1/2的表达水平分别上调至56.3%、66%、35.6%和83.2%（图7c）。这些数据表明己糖激酶和果糖激酶通过“西伯利亚”百合正调节萜类浓度关键结构易失性基因表达的调控。

图7.  LoHXK和LoFRK的过表达定量结果

3.7 LoFRK与LoMYB1和LoMYB2相互作用

果糖激酶与其他蛋白质相互作用以调节植物的多种功能。MYB蛋白在次级代谢产物的调控机制中发挥重要作用。为了研究LoFRK的潜在目标，进行了Y2H测定。数据显示LoFRK与R2R3-MYB蛋白（LoMYB1和LoMYB2）相互作用（图8a），表明LoFRK可能与酵母细胞中的这些蛋白相互作用。

为了进一步验证这些发现，进行了BiFC检测。这构建体通过农杆菌用LoFRK-YFPN/LoMYB1-YFPC、LoFRK-YFPN/LoMYB2-YFPC转移到洋葱表皮中，和YFPC-LoFRK-YFPN。用农杆菌感染洋葱表皮后检测到绿色荧光。DAPI染色后，在细胞核中观察到蓝色荧光，证实LoFRK与细胞核中的LoMYB1和LoMYB2转录因子相互作用（图8b）。这些发现表明果糖激酶可能与LoMYB1和LoMYB2蛋白相互作用以调节花香的产生过程。

图8.  LoFRK与LoMYB1和LoMYB2相互作用

3.8 亚细胞定位分析

亚细胞定位分析显示LoHXK:GFP在线粒体中表达，而LoFRK:GFP与拟南芥原生质体中的核定位信号(NLS)标记的共转化显示细胞核和细胞质中的绿色荧光（图9）。这些数据表明LoHXK位于线粒体中，而LoFRK位于细胞核和细胞质中。

图9.  亚细胞定位分析结果

4. 讨论

在大多数植物中，叶片通过光合作用产生多种形式的碳水化合物，主要是蔗糖和葡萄糖，它们作为各种代谢途径的碳和能量来源。可溶性糖，如Suc、Glc和Fru，也可作为信号分子调节参与发育、防御和代谢的众多基因的表达。在植物中，FRK和HXK是多种代谢途径的看门人，因为它们催化不可逆反应并在植物糖代谢的调节中发挥关键作用。尽管HXK和FRK基因已在‘西伯利百合仍然知之甚少。

在当前的研究中，我们从‘西伯利百合花中分离出LoFRK和LoHXK蛋白并对其进行了功能表征。系统发育和序列比较分析揭示了保守的糖结合（6-磷酸葡萄糖）和ATP结构域存在于LoHXK的推导蛋白质序列中，与AtHXK1和AtHXK2显示出高度相似性（图1）。亚细胞定位分析表明，与AtHXK1类似，LoHXK蛋白定位于线粒体中（图9）。类似地，推断出的LoFRK氨基酸序列具有特征性FRK基因的保守基序和结构域，并且定位于细胞质和细胞核。先前的研究还表明，在质膜、细胞质和细胞核中检测到了几种FRK蛋白。此外，LoFRK和LoHXK的转录水平在花的花药中比在根、茎和叶中更丰富（图2a，3）。在拟南芥和水稻HXKs中观察到类似的模式，其中基因在花中表达最高，在叶和茎中较低。在番茄中，FRK4的mRNA水平仅在花中表达，尤其是在雄蕊中。关于花发育，LoHXK的mRNA水平在开花阶段，而LoFRK在衰老阶段最高，在早期阶段相对较低（图2b）。果糖激酶和己糖激酶的表达模式因植物而异。

有趣的是，在葡萄糖和果糖处理下，罗勒烯和芳樟醇的排放水平增加并遵循昼夜节律。此外，关键结构合成基因的mRNA水平显著上调并遵循相同的昼夜节律模式（图4）。同样，在番茄中，FRK1和FRK2的mRNA丰度随着外源性Glc、Fru或Suc应用而增加，尽管在没有糖处理的情况下无法检测到FRK1转录物。在玉米中也观察到了类似的发现，其中糖水平调节蔗糖合酶基因的表达。此外，使用13C标记实验确定碳通量表明糖类被纳入萜类化合物（图5）。类似的方法在之前的几次测定中进行了测定，以确定碳通量的结合。我们的结果表明外源性Glc而非Fru增加了罗勒烯和芳樟醇的释放，外源性Glc增加了LoTPS1的mRNA丰度，而Fru处理增加了LoTPS3的表达水平。此外，LoFRK和LoHXK的抑制表明，花挥发物的排放，尤其是罗勒烯和芳樟醇，显著下降，这与关键结构挥发性合成基因的表达水平下调一致（图6）。同样，FRK2在白杨（Populus tremuloides）的发育木材中高度表达，它的抑制通过减少发育木材中的磷酸己糖和UDP-葡萄糖池而导致更薄的纤维细胞壁形成。相比之下，LoFRK和LoHXK的过表达导致罗勒烯和芳樟醇的排放水平更高，与关键结构挥发性合成基因的高度上调mRNA转录本一致（图7）。在Malusdomestica（苹果），MdFRK2转录本水平在叶子中最高，过表达导致叶子中的FRK活性增加，碳水化合物水平改变以及参与糖代谢的关键基因（SPS1，SUSY4，NINV1和NINV2）表达改变，这些结果证实了我们目前的研究结果。LeFRK1在毛茛中的过度表达影响了营养生长，籽棉产量和棉铃数量。同样，AtHXK1和AtHXK2的过表达通过控制糖依赖基因的表达/抑制导致糖的溢出性。在本研究中，Y2H和BiFC实验表明LoFRK与LoMYB1和LoMYB2相互作用（图8）。在水稻中，果糖激酶样蛋白1（FLNs）与硫氧还蛋白z（OsTRXz）相互作用以调节叶绿体发育。同样拟南芥FRK样酶（FLN1和FLN2）与AtTRXz相互作用以调节质体基因的表达。同样，AtFRK3与ft(TSF)的双胞胎姐妹相互作用，这是FT (FLOWERING LOCUST)的同源物，在开花调控中起关键作用。亚细胞定位实验表明，与我们的研究结果相似，TSF定位在细胞核中，而AtFRK3主要定位在叶绿体中，然而，本研究中的Y2H和BiFC揭示了这些蛋白质在细胞核中的相互作用。然而，该机制并不完全清楚，因为之前的研究可能表明不能排除这两种相互作用分子之间存在介质。总体而言，这些数据表明Glc和Fru通过调节关键结构合成基因的表达，在花香生产中发挥了重要作用。

5. 结论

简而言之，我们鉴定并鉴定了LoFRK和LoHXK，它们在‘西伯利亚’百合花的雄蕊中高度表达。在Glc和Fru处理下，不仅奥辛烯和芳樟醇的排放水平上升，而且关键结构挥发性合成基因的表达水平随着昼夜节律的增加而上升。LoFRK和LoHXK的过表达和抑制表达表明，它们显著改变了奥辛烯和芳樟醇的排放，以及关键结构基因的表达；此外，LoFRK在体内与LoMYB1和LoMYB2。

6. 小编声明

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