在我国，乳腺癌发病率呈逐渐上升趋势，是严重危害妇女健康的恶性肿瘤。巨噬细胞是乳腺癌微环境的主要细胞类型。肿瘤相关巨噬细胞通常具有促癌和免疫抑制功能，与不良预后相关，但也有报道表明同一肿瘤内可能同时存在具有促癌和抗癌功能的不同巨噬细胞亚群。因此，本文研究者使用单细胞转录组测序技术分析了肿瘤相关巨噬细胞的异质性特征，并发现一种新的抗癌巨噬细胞亚群，为靶向巨噬细胞的癌症治疗提供了新的思路。
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文章题目：Tissue-resident FOLR2+ macrophages associate with CD8+T cell infiltration in human breast cancer
中文题目：组织驻留型FOLR2+巨噬细胞与人乳腺癌中CD8+ T细胞浸润有关
发表时间：2022年3月
期刊名称：Cell
影响因子：41.582
实验平台：流式细胞分选技术、10x Chromium单细胞转录组测序、IHC、激光共聚焦显微成像技术等
DOI：10.1016/j.cell.2022.02.021
研究思路
研究内容
1、APOE表达鉴定乳腺癌中的TAMs
研究者使用一个未接受过治疗的管腔型乳腺癌（BC）患者队列样品，分析了匹配的原发肿瘤中非转移和转移的淋巴结（LN）内的单核巨噬细胞数量，并发现癌转移LNs中CD1c-CD14+单核细胞/巨噬细胞数量较非转移LNs显著增加（图1A），CD14+细胞浸润与LNs肿瘤侵袭程度有关（图1B）。接下来，研究者从癌转移LNs、原发肿瘤和血液中分离出单核巨噬细胞并进行单细胞转录组测序（图1C），得到了约18000个髓系细胞并进行细胞注释（图1D和E）。此外，APOE同源表达选择性地将TAM与CD14+单核细胞和CD1c+DCs区分出来（图1F）。从蛋白表达水平上，利用染色实验发现APOE和CCR2可以将巨噬细胞/TAMs与CD1c-CD14+细胞内的单核细胞区分开，随着肿瘤负荷增加，CD14+细胞内APOE+巨噬细胞比例也随之增加，而CCR2+单核细胞比例降低（图1G）。综上所述，研究者找到了APOE，作为鉴定管腔型BC原发肿瘤和癌转移LNs中巨噬细胞的特异标志物。
Fig.1 APOE表达定义了乳腺癌中的肿瘤相关巨噬细胞
2、单细胞RNA测序揭示了两种APOE+巨噬细胞亚群
通过对找到的APOE+TAMs进行亚亚群分析，得到了三个亚亚群，系统聚类分析发现三个亚亚群中0和1在转录上关系更近（图2A和B）。利用SCENIC进一步探究巨噬细胞转录异质性发现0和1有约一半的共同调控子，而2则有一些独特的调控子（图2C）。基因表达差异分析表明，FOLR2、SEPP1、SLC40A1、MRC1和LYVE1在2中高表达，而TREM2、SPP1、ISG15则在0和1中高表达（图2D）。其中，FOLR2是2的定义marker，TREM2是0和1的定义marker。总之，APOE+巨噬细胞中包含2种细胞类型：TREM2+或FOLR2+巨噬细胞（图2E）。然而，在TAMs的细胞表面未能检测到TREM2蛋白的表达，不过在亚亚群1（Trem2high巨噬细胞）中发现CADM1的特异性表达，其染色也呈阳性（图2F和G）。从原发癌和癌转移LNs中分选出FOLR2+CADM1-和FOLR2lowCADM1+巨噬细胞，发现前者呈典型的巨噬细胞形态并充满空泡，而后者体积更小，形态更接近单核细胞（图2G）。对FORL2+CADM1-巨噬细胞、FOLR2lowCADM1+巨噬细胞和CD14+CCR2+单核细胞进行bulk RNA测序，发现FOLR2+巨噬细胞与另外两种细胞距离较远，且高表达FOLR2、SEPP1、SLC40A1和LYVE1（图2H-J）。这些结果表明，乳腺TAMs由两种细胞群组成，它们可以通过TREM2/CADM1和FOLR2的互斥表达区分。
Fig.2 单细胞转录组测序揭示了两个APOE+巨噬细胞亚群
3、FOLR2+巨噬细胞是组织驻留性巨噬细胞
研究者结合近期研究结果和自己的发现，认为TREM2+CADM1+巨噬细胞来源于肿瘤发展过程中循环单核细胞的浸润，而FOLR2+巨噬细胞的起源尚不清楚。为了解决这个问题，研究者利用质谱流式技术对健康组织和乳腺肿瘤病变组织中的FOLR2+巨噬细胞进行了定量，发现在APOE+巨噬细胞中，FOLR2+巨噬细胞富集在正常组织和癌旁中，并随着肿瘤发展，其比例被FOLR2-巨噬细胞稀释（包括TREM2+巨噬细胞）（图3A），但由于正常组织和肿瘤中FOLR2+巨噬细胞在总活细胞比例中保持稳定，说明在肿瘤病变中，FOLR2+巨噬细胞群体并没有减少。通过对TCGA数据库中不同亚型的BC样本的分析，也在转录水平上证实了FOLR2+巨噬细胞在邻近正常组织比肿瘤病变组织富集程度更高，IHC分析显示FOLR2+巨噬细胞在BC各亚型中均有表达（图3B和C）。此外，前面的研究中发现FOLR2+巨噬细胞特异性表达LYVE1和MRC1/CD206，这些都是血管周围（PV）巨噬细胞的marker，共聚焦成像显示FOLR2+CD206+巨噬细胞确实位于肿瘤和邻近组织中CD31+血管附近（图3D）。综上所述，FOLR2+巨噬细胞是与健康乳腺（MG）相关的PV组织驻留巨噬细胞（TRM）。
接下来，研究者利用小鼠模型进行单细胞测序来分析巨噬细胞，共鉴定到3个巨噬细胞亚群，其中两个表达Cadm1(0和1两个亚群)（图3E），第三个离散亚群（2号亚群）为Folr2+Mrc1+巨噬细胞，人和小鼠的FOLR2+巨噬细胞共同表达FOLR2、MRC1、LYVE1和MAF（图3F）。为了探索人和小鼠FOLR2+巨噬细胞之间的相似性，研究者在单个细胞水平进行同源基因的相似性分析，证实了小鼠Folr2+巨噬细胞和人FOLR2+巨噬细胞的一致，说明FOLR2+巨噬细胞在小鼠和人管腔型乳腺癌之间是保守的（图3G）。在健康（WT）、病变前、肿瘤性病变、早期癌和晚期癌小鼠中分析FOLR2+和CADM1+巨噬细胞动态变化。其中，FOLR2+巨噬细胞约占健康MG巨噬细胞总数的80%，并随着肿瘤进展而逐渐减少，在晚期癌中达到最低值（图3H）。根据上述结果，研究者得出结论FOLR2+巨噬细胞是一种在晚期癌症中持续存在且进化上保守的TRM亚群。
Fig.3 FOLR2+ 巨噬细胞是组织驻留的巨噬细胞
4、FOLR2+巨噬细胞与BC患者的生存期增加相关
通常认为巨噬细胞促进肿瘤生长并抑制抗肿瘤免疫。因此，研究者接下来探求FOLR2+巨噬细胞是否同样与BC患者较差的生存率有关。本研究中发现的三个巨噬细胞亚群（图2A）均表达了C1QA、C1QB和C1QC，足以区分巨噬细胞和其他白细胞谱系。FOLR2、SEPP1 和 SLC40A1能将FOLR2+巨噬细胞和其他巨噬细胞与白细胞谱系区分开来（图4A和B）。生存分析发现最高水平的巨噬细胞浸润与较差的总生存期相关，但是高水平表达的FOLR2+巨噬细胞特征基因则与总生存期增加相关，在不同亚型BC患者队列中也能发现这一点（图4C）。此外，通过染色成像计算FOLR2+巨噬细胞密度，发现其密度与患者生存期呈正相关（图4D和E）。上述这些结果表明 FOLR2基因特征和 FOLR2+巨噬细胞丰度与BC患者的更好预后相关。
Fig.4 FOLR2+巨噬细胞与乳腺癌患者的生存期增加相关
5、FOLR2+巨噬细胞存在于肿瘤基质中，并且在空间上与癌症中的TREM2+巨噬细胞分离
除了乳腺癌，研究者继续探究FOLR2+巨噬细胞在不同肿瘤中是否存在，为此分析了80多个肿瘤切片中FOLR2+细胞的分布，并在这些癌症中发现了FOLR2+巨噬细胞，其持续存在于肿瘤基质内，很少浸润肿瘤巢（图5A）。对多种肿瘤连续切片进行FOLR2和TREM2的染色分析，发现TREM2+巨噬细胞在肿瘤巢附近浸润或分布，而FOLR2+巨噬细胞主要位于肿瘤基质。某些癌症中TREM2+巨噬细胞同时存在于肿瘤基质和肿瘤巢，而FOLR2+巨噬细胞仍位于肿瘤基质中（图5B）。为了测试肿瘤基质中巨噬细胞丰度是否与临床结果有关，分析了一个BC瘤周基质区域基因芯片数据集结果，发现FOLR2特征基因集与更好的生存期密切相关，低FOLR2则比较差，与TREM2相反（图5D）。研究者得出结论FOLR2+巨噬细胞和TREM2+巨噬细胞在肿瘤微环境中的空间分布彼此分离，它们在肿瘤基质中的丰度与BC患者不同的临床结果有关。
Fig.5 FOLR2+巨噬细胞与TREM2+巨噬细胞在空间上分离
6、FOLR2+巨噬细胞在CD8+T细胞浸润的肿瘤中富集，并与癌症中的淋巴聚集体共定位
利用FOLR2特征基因集或FOLR2表达来将FOLR2+巨噬细胞的丰度与肿瘤微环境中的其他免疫和基质细胞类型相关联，结果表明FOLR2特征基因集（或FOLR2）与CD8+ T细胞、DC、B细胞和三级淋巴结构（TLSs）等已知的抗肿瘤免疫因子呈正相关（图6A）。水平最高的FOLR2表达与多淋巴细胞谱系的协调浸润和TLS的基因特征一致（图6B）。肿瘤中的FOLR2表达与各种免疫通路之间存在很强的相关性。与CDAM1+TREM2+巨噬细胞相比，在bulk RNA测序数据集中，对FOLR2+巨噬细胞富集了趋化性和免疫反应调节功能模块通路，表明FOLR2+巨噬细胞是抗肿瘤免疫启动的免疫环境的一部分（图6C）。因为CD8+ T细胞在包括BC在内的各种癌症类型中与更好的生存期有关，因此研究者探求FOLR2+巨噬细胞是否与肿瘤浸润性CD8+T细胞互作。通过对肿瘤切除标本进行观察，发现CD31+血管附近的FOLR2+巨噬细胞与CD8+T细胞聚集体密切相关（图6D）。FOLR2+巨噬细胞含量高的肿瘤中CD8+T细胞密度显著高于FOLR2+巨噬细胞含量低的肿瘤（图6E）。这些结果说明基质相关的FOLR2+巨噬细胞是肿瘤巢附近淋巴聚集体的结构成分。
为了进一步研究这两种细胞类型是否能有效的结合，研究者对BC病变样品进行共聚焦实时成像，针对CD8、FOLR2、EPCAM来染色肿瘤病灶的CD8+T细胞、FOLR2+巨噬细胞和EPCAM+肿瘤细胞，随后通过延时显微镜对细胞动力学成像，发现CD8+T细胞降低了它们的速度并与FOLR2+巨噬细胞建立了长期联系，这与FOLR2缺失的肿瘤区域中CD8+T细胞的高流动性形成了鲜明对比（图6F）。这些结果揭示CD8+T细胞与FOLR2+巨噬细胞建立了长期的相互作用，这一行为可能促进T细胞的激活。与此结果一致，肿瘤全转录组中FOLR2表达与控制T细胞毒性功能的基因呈正相关，但与T细胞功能障碍的基因无关（图6G）。总之，肿瘤浸润性CD8+T细胞主动与FOLR2+巨噬细胞结合，这种相互作用与CD8+T细胞的激活和患者的生存呈正相关。
Fig.6 FOLR2+巨噬细胞在浸润肿瘤的CD8+T细胞中富集，并与淋巴聚集体共定位
7、FOLR2+巨噬细胞能够响应肿瘤生长并获得T细胞启动能力
为了解析FOLR2+巨噬细胞的功能特征，研究者利用bulk RNA测序技术来分析健康和中小型肿瘤小鼠乳腺中分离得到的FOLR2+巨噬细胞。主成分分析结果表明从乳腺肿瘤中分离的FOLR2+巨噬细胞以肿瘤大小依赖性方式改变其转录组表达谱（图7A）。乳腺癌和健康小鼠FOLR2+巨噬细胞中有1356个差异表达基因（DEG），其中肿瘤的表达参与免疫系统正调节如B、T细胞趋化因子等、黏附分子、溶酶体蛋白基因。而健康小鼠则富含调节代谢过程的基因，说明FOLR2+TRMs响应肿瘤发展（图7B和C）。为了测试乳腺癌FOLR2+和CADM1+巨噬细胞是促炎性（M1）还是抗炎性（M2）巨噬细胞，分析了这两个细胞群M1或M2特征基因的表达情况，发现这两个细胞群均表达M1或M2的部分基因，说明肿瘤微环境中巨噬细胞激活不符合体外M1/M2极化模型（图7D）。抗原特异性T细胞启动实验发现FOLR2+巨噬细胞表现出更强的诱导初始T细胞激活、扩增、多功能性和细胞毒性的能力。此外，从健康MG中分离的FOLR2+巨噬细胞不能有效激活CD8+T细胞，而从乳腺癌中分离出来的FOLR2+巨噬细胞可以诱导T细胞扩增和分化（图7E和F）。这些结果证实了FOLR2+巨噬细胞在肿瘤发展过程中被激活，并获得了激活CD8+T细胞的能力。综上所述，研究者提供了FOLR2+巨噬细胞不像免疫抑制细胞的证据。相反，肿瘤相关的FOLR2+巨噬细胞是强大的抗原提呈细胞，具有触发CD8+T细胞激活的功能。
Fig.7 FOLR2+巨噬细胞响应肿瘤生长并获得启动T细胞的能力
主要结论
本研究鉴定到一种在健康乳腺和乳腺癌原发肿瘤中存在的FOLR2+组织驻留巨噬细胞群。
1、FOLR2+巨噬细胞位于肿瘤基质的血管周围区域，在那里它们与CD8+T细胞相互作用。
2、FOLR2+巨噬细胞在体外可有效激活效应CD8+T细胞。
3、肿瘤中FOLR2+巨噬细胞的密度与患者较好的生存期呈正相关。
综上所述，研究者揭示了肿瘤相关巨噬细胞亚群的特定作用，并为在基于巨噬细胞的癌症治疗研究中的亚群靶向治疗干预思路铺平了道路。
参考文献
Nalio Ramos, Rodrigo et al.“Tissue-resident FOLR2+ macrophages associate with CD8+ T cell infiltration in human breast cancer.”Cell vol. 185,7 (2022): 1189-1207.e25.
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