Hepatic stellate cell activation promotes alcohol-induced steatohepatitis through Igfbp3 and SerpinA12

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Title: Hepatic stellate cell activation promotes alcohol-induced steatohepatitis through Igfbp3 and SerpinA12
Journal: Journal of hepatology
Date: 2020
IF: 20.582
Doi: 10.1016/j.jhep.2020.02.005
文献指数：⭐️⭐️⭐️⭐️

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【Abstract】

背景: 脂肪性肝炎（Steatohepatitis）在酒精相关肝疾病中促进纤维形成。最近研究显示HSCs可能调节肝纤维化之前的薄壁细胞损伤和炎症，尽管其机制还未完全阐明。NRP-1和synectin是参与HSCs激活的膜蛋白。在本研究中，我们通过破坏NRP-1和synectin作为模型来评估小鼠酒精喂养后HSCs活化对脂肪性肝炎发展的作用。
方法 HSCs细胞经选择性敲除NRP-1或者synectin的小鼠，喂养对照饮食或者慢性/酗酒喂养模式。检测脂肪肝和炎症相关的标志蛋白。
结果 敲除NRP-1的小鼠表现为更少的纤维化、炎症以及脂肪变性，肝甘油三酯含量降低。敲除synectin的小鼠也得到了类似的结果。使用来源于条件敲除小鼠肝中的HSCs培养上清处理肝细胞与正常细胞上清相比，能够减少酒精诱导的脂滴形成。从NRP-1敲除的HSCs上清液中脂肪因子和炎症蛋白阵列显示Igfbp3显著降低，SerpinA12表达上调。重组Igfbp3诱导脂滴形成，甘油三酯累积和肝细胞脂肪生成基因表达。然而，SerpinA12可以保护酒精诱导的肝脂肪变性。最后，在酒精性肝炎患者的血清盒肝组织中检测到Igfbp3表达上调，SerpinA12的表达下调。
结论 选择性敲除HSCs中的NRP-1可以通过调节Igfbp3和SerpinA12信号通路减弱酒精诱导的脂肪性肝炎。

【Results】

选择性敲除NRP-1导致的HSCs细胞激活受损减少了乙醇(EtOH)诱导的纤维化、炎症和脂肪变性

建立条件敲除NRP-1的 小鼠模型，在HSCs细胞中敲除NRP-1。通过WB和TGF-b刺激实验来验证敲除的效果。NRP-1敲除之后，HSCs激活情况下调了（a-sma和Collagen I的mRNA水平下调）。然后建立酒精性脂肪肝的模型，用天狼星红染色，检测纤维化，发现敲除NRP-1后纤维化水平下调了，a-Sma，Col1a1和Timp-1的mRNA水平都下调了。

基于HSCs可能调节脂肪变性和炎症促进肝纤维化的假设，我们想要知道选择性的敲除HSCs的NRP-1是否能够保护酒精引起的脂肪变性和炎症。对照小鼠饲喂慢性/暴酒精，表现出明显的脂肪变性，相对于正常饮食组，而敲除NRP-1的小鼠表现出酒精诱导的脂肪变性的保护作用【通过Oil-red O染色结果展示】；同时再NRP-1敲除的小鼠中甘油三脂的含量下调了50%。炎症因子（Tnf-a, Il-1b和Mcp-1）的mRNA水平在对照组中升高了，而敲除NRP-1组却没有。肝组织CD68染色，以显示巨噬细胞浸润也的到了类似的结果。炎症病灶量化结果（flammatory foci quantification）也是一致的。

<u>这部分用到的实验：</u>首先是条件敲除NRP-1的小鼠模型和HSCs细胞，然后建立酒精性脂肪肝的模型。天狼星红染色检测纤维化，mRNA水平检测想纤维化指标，炎症指标，油红染色检测脂质形成，甘油三脂含量检测，肝组织CD68检测局势细胞浸润和HE染色检测炎症病灶。

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ColCre/Nrp1loxP小鼠HSCs细胞来源的上清可以减少乙醇暴露的肝细胞的脂滴形成

通过观察HSCs选择性敲除NRP-1可预防酒精性脂肪变性，假设HSCs能够产生NRP-1依赖的旁分泌信号来调节杆脂肪变性。

从条件敲除小鼠中分离培养敲除NRP-1的HSCs细胞。收集培养上清添加不同浓度的酒精，处理原代肝细胞。发现脂滴形成是减少的【通过BODIPY染色】。然后在人细胞中敲除NRP-1，将肝细胞放在底部，HSCs放在上室的间接共培养的方法。然后暴露与酒精，并检测脂滴形成。然后也分离人的HSCs来实验也得到了类似的结果。

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NRP-1敲除的HSCs细胞上清液和细胞裂解液中Igfbp3表达降低，SerpinA12表达增加

取NRP-1敲除HSCs细胞的上清做adipokine and inflammatory protein array（脂肪因子和炎症蛋白阵列），检测到Igfbp3表达相对于对照降低了4.4倍，而SerpinA12增加了2.4倍。然后进行了qPCR和上清WB的验证。

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重组Igfbp3增加体外肝细胞脂滴形成、甘油三酯含量和脂肪基因表达

用重组Igfbp3可以促进脂滴的形成，效果和酒精处理类似，并且两者具有协同的效果【通过BODIPY染色以及甘油三脂含量检测】。

Igfbp3通过src激酶信号增强原代肝细胞中的p-Akt

Igfbp3重组蛋白处理小鼠后，小鼠肝细胞中p-Akt增加了6.2倍。IGF-1R和Erk没有明显变化

SerpinA12处理可通过p-AMPK途径预防乙醇诱导的脂肪变性

SerpinA12重组蛋白处理小鼠，发现被酒精处理导致的p-MAPK下调又上升了，而这种作用能够被MAPK抑制剂所抑制。

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酒精性肝病患者血清和肝组织中Igfbp3升高，SerpinA12降低

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【Discussion】

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激活的HSCs促进Igfbp3和降低serpinA12的释放，以旁分泌的效果作用于肝细胞，Igfbp3通过整合素受体促进p-akt信号通路，导致脂滴形成，甘油三酯含量增加，脂肪生成基因表达；乙醇降低p-AMPK，促进脂生成。SerpinA12通过促进p-AMPK抵抗酒精诱导的脂肪变性。

HSCs不仅调节纤维化，而且能够调节脂肪变性。HSCs产生细胞因子和趋化因子，作为抗原呈递细胞。激活的HSCs可以释放IL-6和TNF-a，抑制HNF1a和SHP-1导致炎症和纤维化。

【Evaluation】

这篇文章主要是通过NRP-1和synectin条件敲除的HSCs以及建立的酒精性脂肪肝动物模型，发现敲除NRP-1导致了Igfbp3的表达下调和serpinA12释放增加，这两者均减轻了酒精导致的脂肪变性和炎症，缓解了脂肪肝；而在真实的酒精性脂肪肝患者体内检测到这两个分子的表达变化。其重要意义在于一定程度上解释了酒精性脂肪肝的形成，以及潜在标志蛋白发现。没有解释的问题有：很难证明Igfbp3和SerpinA12在酒精性脂肪性肝炎发展中的因果关系。ColCre的敲除策略可以不是HSCs特异性的。