博文名称：Normalizing single cell RNA sequencing data — Pitfalls and Recommendations
博文链接：https://towardsdatascience.com/normalizing-single-cell-rna-sequencing-data-pitfalls-and-recommendations-19d0cb4fc43d
博文发表时间：Jan 29, 2020
单细胞RNA测序(scRNA-seq)的目的通常是亚群鉴定和差异基因表达分析。 为避免“维度灾难”（curse of dimensionality），将高可变基因 (HVG) 用于聚类分析。 多项研究表明，HVG对原始计数矩阵标准化方法的选择很敏感。
为什么要标准化？
原始read计数不能直接用于比较细胞之间的基因表达，因为它们会被实验技术和“无趣”的生物变异所混淆（干扰）。 通过QC质控步骤和其他方法可用于过滤和回归无趣的生物变异。 虽然PCR扩增偏差通常可以通过使用唯一分子标识符 (UMI) 来处理，但需要标准化以消除其他技术引起的变异，如测序深度、细胞裂解和逆转录效率的差异。
标准化（Normalization）处理的主要目标是消除技术效应的影响，同时保留真正的生物学异质性。在标准化处理良好的数据集中，一个基因的方差应该与细胞的基因丰度和测序深度无关。 “真正”差异表达的基因应该在不同细胞类型之间表现出高差异，而看家基因应该表现出低差异。
因此，标准化是一个关键的预处理步骤，它会极大地影响scRNA分析的下游应用。 不幸的是，scRNA数据集通常沿用从bulk RNA-seq继承的方法进行标准化，但是，由于技术性质的差异和这些数据集的固有复杂性，我们很快就会看到这些方法是不合适的。
在这篇博文中，我们将看到全局缩放方法（global scaling methods）在scRNA-seq分析中的局限性。 我们还将讨论最近推出的SCNorm和SCTransform归一化方法的潜力优势，这些方法专为单细胞分析量身定制。
全局缩放方法（Global Scaling methods）
传统上，使用RPKM（每千碱基百万读取数）、FPKM（每千碱基百万片段）或 TPM（每百万转录本）方法将跨细胞的原始表达计数通过测序深度进行标准化。 要了解它们的工作原理，请观看此视频。 虽然这些方法适用于样本内标准化，但它们已广泛认为不适合样本之间的差异表达分析。
例如，考虑在两个处理条件—对照组和治疗组之间，比较两个基因A和 基因B的表达的情况。 基因A在两种处理下的表达水平相同，而基因B在处理组中细胞的表达水平高出2倍。 TPM归一化将绝对表达值转化为相对表达值，因此，我们可能会得出结论，如果基因B在两组间是差异表达的，那么基因A也是差异表达的。
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基于基因集的方法（Gene group based methods）
基于基因集的方法为了解决全局缩放方法的固有问题，最近引入了两种有趣的归一化方法 - SCnorm (2017) 和 SCTransform (Seurat package v3, 2019)。
SCnorm
SCnorm是 Bioconductor上的R包。 对于每个基因，SCnorm通过分位数回归（quantile regression）估计基因表达对测序深度的依赖性。 然后将具有相似依赖性的基因进行分组，并使用第二个分位数回归来估计每组的缩放因子（ scale factors）。 最后使用每个组特定的缩放因子调整每个基因集的测序深度，以生成标准化的基因表达估计。
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单个细胞数据集（Bacher et al）中3个基因表达
A：原始计数与测序深度，B：标准化的全局缩放因子与测序深度，C：SCnorm计数与测序深度
上图显示来自单个样本的细胞数据集中三个基因的计数深度关系。 图 A 是未标准化或原始表达计数。 很明显，与图C 中的 SCnorm 相比，基于全局缩放因子的方法（图 B）在标准化方面做得很差。
SCTransform
SCTransform是可用于Seurat v3的R包。 该方法使用正则化负二项式模型（regularized negative binomial model）对UMI计数进行建模，以消除因测序深度引起的变化。 简而言之，该方法首先使用测序深度作为自变量和UMI计数作为响应或因变量为每个基因构建广义线性模型 (GLM)。 然后根据基因表达对参数估计进行正则化（或调整）。 使用正则化参数应用第二轮负二项式回归。 该模型的输出（残差）是每个基因的标准化表达水平。
这里的关键信息是，SCnorm 和 SCTransform 方法都学习基因集（gene-group ）特定的因素，而不是使用常数因子来标准化所有基因。 这些因素分别针对低、中和高表达基因，消除了技术变异的影响，同时保留了真正的生物异质性。
总结
归一化方法的选择会影响高变异基因的选择，从而影响scRNA数据的所有下游分析。 直接将bulk RNA-seq的归一化方法应用于scRNA数据集是不合适的。 推荐通过选择SCNorm或SCTransform归一化方法来更新分析流程并充分利用最新的技术方法是值得的。
对RPKM，FPKM，TPM的理解
在RNA-Seq的分析中，对基因或转录本的read counts数目进行标准化（normalization）非常重要，因为落在一个基因区域內的read counts数目取决于基因长度和测序深度。一个基因越长，测序深度会越高，落在其內部的read counts数目就会相对越多。因此，我们使用相对测量，而不是绝对测量。
因此，我们需要标准化的两个关键因素就是基因长度和测序深度，常常用RPKM (Reads Per Kilobase Million), FPKM (Fragments Per Kilobase Million) 和 TPM (Transcripts Per Million)作为标准化数值。
1. RPKM
计算RPKM主要包括以下三步：
- 计算与测序深度有关的系数：计算每个样本中reads的总数并除以
—此时就可以得到"per million"的缩放系数；
- 去除测序深度的影响：每个reads数除以上面得到的"per million"缩放系数，得到对应基因在每百万reads中所占比例，即reads per million (RPM)；
-
去除基因长度的影响：用上一步的结果再除以对应基因的长度（通常是所有外显子长度的总和，以kb为单位），得到每百万reads每一千碱基对中包含的reads数，即RPKM。
计算RPKM的公式可以表示如下：
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其中：
-
可以表示一个基因或转录本，或基因组上一段特定的区域；
-
表示比对到基因x外显子区域的reads数；
-
表示当前样本中包含的全部reads数，
，其中N表示该样本中的基因总数；
-
表示基因x外显子区域包含的碱基数（bp）
RPKM的计算
2. FPKM
FPKM与RPKM的计算过程相同，它们的区别是：RPKM用于单端测序结果，FPKM用于双端测序结果（如图2所示）。因为双端测序中，每一个fragment会包含两个reads，使用FPKM来计算基因的表达丰度时，可以避免把同一个fragment的两个reads计算两次（实际上只需要计算一次）。
单端测序read与双端测序read
单端read与双端read比对到基因组的示意图所示：
单端测序read与双端测序read比对到参考基因组
3.TPM
TPM与RPKM最大的区别在于消除两种影响的次序：在TPM中先消除基因长度的影响，再消除测序深度的影响。计算TPM的过程也可以分为三个步骤：
- 将每个read counts除以对应基因的长度（外显子区域的长度，单位为kb），此时得到每千个碱基包含的reads数，即（reads per kilobase, RPK）；
- 将一个样本中的RPK加起来的总数除以
- 用RPK除以"per million"缩放系数，得到TPM。
计算公式表示如下：
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其中：
-
-
表示reads的长度（例如所有reads包含的平均碱基数），一般为常数；
-
-
表示当前样本中所有基因除以自身长度（kb）后求和的结果，
，其中N表示该样本中的基因总数；
-
因为交换了两次计算的次序，TPM最终得到的结果中，每个样本总的TPM值是相同的，这样的结果便于样本间差异的比较。
案例说明
有以下RNA-seq数据，测定了A、B、C、D四个基因，长度分别是2、4、1、10kb，共测定了3个生物重复：Rep1、Rep2、Rep3。
1. RPKM的计算
第一步，计算总Read数
由于只有4个基因，所以总Read数并没有太大，因此使用10模拟百万进行总read换算。
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第二步：标准化总Read数
将Rep1、Rep2、Rep3除以各自换算后的总Read数（也就是3.5，4.5，10.6），得到RPM：
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第三步：标准化基因长度
再将基因A、B、C、D的RPM值除以各自的基因长度，得到RPKM：
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2. TPM的计算
RPKM是先进行测序深度标准化，后进行基因长度标准化；而TPM是先进行基因长度标准化，后进行测序深度标准化 。事实证明，TPM的标准化方法更有优势，为何会这样，见后述。这里先看看TPM的计算。
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第一步：进行基因长度标准化。先将基因A、B、C、D的Read数除以各自的基因长度（基因长度单位kb），得到RPK。
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第二歩：计算总Read数（RPK）。计算总Read数，并将其进行百万转换。由于基因数太少，这里是使用10模拟百万转换。
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问题1：RPKM和TPM那种计算方法更优？
详见黄树嘉的《为什么说FPKM和RPKM都错了？》
问题2：seurat的归一化和TPM是不是一致的？
TPM的归一化考虑了基因长度和测序深度，而seurat的归一化没有考虑基因长度，只考虑了测序深度，为什么不需要考虑基因的长度？
每个归一化方法内在的考虑因素不相同，TPM考虑了基因长度，基因越长，落在基因序列上的reads数量也相应越多。
归一化还跟它要解决的问题相关。
- 差异表达分析，如果我们只比较某个基因在样本组间的差异，基因的长度是固定影响因素（恒定因子），可以不用考虑基因长度的影响。
- 如果比较同一个样本中的不同基因，考虑基因的长度问题，把基因放在到同一赛道上比较。
另外，seurat在比较不同基因时，对归一化的基因表达值进行scale处理。
10X官方也答复了该问题：
https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/115003684783-How-to-calculate-TPM-RPKM-or-FPKM-instead-of-counts-
Should I calculate TPM, RPKM or FPKM, instead of counts for 10x Genomics data?
答：在10x Genomics基因表达分析中，每个转录本都标记有唯一的分子标识符（UMI）序列。这些UMI能够准确定量基因表达水平，因为我们可以判断哪些read是由相同的mRNA分子产生的。因此，Cell Ranger和Space Ranger执行UMI计数（非read计数）以测量基因表达水平，并且所有下游分析步骤均基于UMI计数执行。
传统的RNA-seq数据中，完整的转录本被片段化，随后是cDNA合成、末端修复和接头连接。在此实验流程中，从长转录本中提取fragment片段的概率高于从短转录本中提取的概率。因此，TPM、RPKM、FPKM通过转录本长度（基因的长度）对read计数进行标准化是有意义的。然而，在10x基因表达分析中，这种基因长度偏差并不存在。因此，我们不建议通过基因长度使UMI计数标准化。
10X单细胞测序的UMI标签，消除PCR扩增的偏好性；
- UMIs enable accurate quantitation of gene expression levels because we can tell when reads are generated from the same mRNA molecule.
- In traditional RNA-seq workflow, the probability of sampling a fragment from a long transcript is higher than from a short one.
- in 10x single cell 3’ or 5’ gene expression assay, this gene-length bias does not exist.
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参考：
https://www.plob.org/article/16013.html
https://www.cnblogs.com/Belter/p/13205635.html
https://www.jianshu.com/p/1940c5954c81?from=groupmessage
https://www.jianshu.com/p/35e861b76486
https://bioinfo.umassmed.edu/content/pdf2016fall/normalization.pdf
https://www.cnblogs.com/emanlee/p/14933354.html
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