最新中国脑脊液mNGS前瞻性多中心研究：首次采用ROC曲线判定mNGS阳性阈值
Xing X W, Zhang J T, Ma Y B, et al. Metagenomic Next-Generation Sequencing for Diagnosis of Infectious Encephalitis and Meningitis: A Large, Prospective Case Series of 213 Patients[J]. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 2020, 10.
ROC曲线法确定阈值：该文统计学方法有明显错误，ROC曲线只有一个数据点，AUC成了三点连线下面积。暂且先不管该统计学方法，解读文章如下：
错误的ROC曲线法
Frontiers in Cellular and Infection Microbiology
摘要
目的：我们评估了宏基因组二代测序（mNGS）在感染性脑炎和脑膜炎中的诊断性能。
方法：这是一项前瞻性多中心研究。对病毒性脑炎/脑膜炎、结核性脑膜炎、细菌性脑膜炎、真菌性脑膜炎和非中枢神经系统(CNS)感染患者的脑脊液样本进行mNGS检测。
结果：从2016年11月至2019年5月，总共有213名感染性和非感染性CNS疾病的患者入组； 明确CNS感染的mNGS阳性检出率为57.0％。 在种特异性序列（ species-specific read number，SSRN）≥2时，mNGS在确定性病毒性脑炎/脑膜炎的诊断中表现最佳（曲线下面积[AUC] = 0.659，95％置信区间[CI] = 0.566–0.751）【表述有误，其实是三点下面积:<】）; 阳性率为42.6％。 在属特异性序列（genus-specific read number）≥1的情况下，mNGS在诊断结核性脑膜炎（临床判定为确定或可能）中的表现最佳（AUC = 0.619，95％CI = 0.516–0.721）； 阳性率为27.3％。 当SSRNs≥5或10时，细菌性脑膜炎的诊断性能最佳（AUC = 0.846，95％CI = 0.711–0.981）； 灵敏度为73.3％。mNGS（SSRN≥2）在诊断隐球菌性脑膜炎和脑曲霉病中的敏感性分别为76.92和80％。
结论：脑脊液mNGS能有效识别引起感染性中枢神经系统疾病的病原体。 mNGS应与常规微生物检测结合使用。
文章推荐：
①用SSRN ≥2诊断病毒性和真菌性CNS感染
②SSRN ≥5或10诊断细菌性CNS感染
③属特异性序列数 ≥1诊断结核性脑膜炎
1. 介绍
感染性脑炎和脑膜炎在世界范围内发病率和死亡率都很高。然而，50%的急性脑炎患者未能发现特异性病原体，因为可用的脑脊液(CSF)体积可能较少，血脑屏障导致病原体滞留在大脑中。传统的微生物测试(涂片、培养、免疫学检测和聚合酶链反应)往往无法检测到引起脑炎和脑膜炎的病原体。如果早期检测不能准确识别病原体，治疗往往是不适当的，可能引发严重的并发症或死亡。病毒性脑炎和脑膜炎、结核性脑膜炎、细菌性脑膜炎和真菌性脑膜炎是感染性脑炎和脑膜炎的主要病例。然而，这四种类型的感染可能表现出相似的临床表现和脑脊液表现(例如，颅内压，以及白细胞、葡萄糖和蛋白质水平)。与传统方法相比，缺乏同时鉴定微生物，包括各种病毒、细菌、真菌的可靠方法。
宏基因组二代测序(mNGS)是一种新颖和有前途的方法，它允许同时和无偏倚地鉴定人类样本中的所有微生物。一些研究使用mNGS来诊断感染性中枢神经系统(CNS)疾病，但大多数研究的样本量较小，且集中于特定的病毒、细菌、真菌或原核生物。最近，一项规模更大的研究(58名患者)发现，mNGS提高了神经系统感染的诊断，但mNGS阳性率仅为22%。因此，mNGS在感染性脑炎和脑膜炎诊断中的性能应该用更大的样本来研究。此外，由于微生物基因组的大小和习性不同，对mNGS数据的解释需要仔细分析。因此，我们开展了一项大型前瞻性研究，以评估mNGS在感染性脑炎和脑膜炎的诊断性能。
2. 方法
2.1 研究设计
本前瞻性多中心研究利用中国北京的六所教学医院的临床资料诊断感染性脑炎和/或脑膜炎。纳入标准为：临床高度怀疑CNS感染性疾病；和有腰穿结果的非感染病人。排除标准为：拒绝腰椎穿刺；任何此类穿刺的禁忌症；以及自身免疫性脑炎的诊断。符合条件的患者根据最终诊断分为五组：病毒性脑炎和/或脑膜炎、TBM、细菌性脑膜炎、真菌性脑膜炎和中枢神经系统非感染性疾病。我们纳入了确诊或可能诊断为CNS病毒感染、TBM 和细菌性脑膜炎的患者，经常规微生物检测确诊为真菌性脑膜炎。隐球菌性脑膜炎经墨汁染色或真菌培养，以及组织病理学证实的脑曲菌病。所有患者均接受了至少3个月的随访。图1显示了研究的流程图。
图1 Flowchart of study participants
2.2 脑脊液mNGS
脑脊液标本按照标准无菌程序采集，快速冷冻，- 20℃保存，24小时内进行mNGS处理。健康志愿者血液样本的DNA打碎成片段，按一定比例与水混合(阴性对照)。DNA提取，及文库构建后将玻璃珠加入CSF样品中并剧烈搅拌。在BGISEQ-500/50平台(BGI-天津，天津，中国)进行测序，每个样本平均获得20M个reads。去除人类序列后，其余数据与细菌、病毒、真菌和原生动物数据库进行比对，在其他地方有详细描述(Xing et al.， 2018, 2019)。
2.3 mNGS结果解读
与阴性对照相比，在去除常见背景微生物和过去3个月内>50%的样品中出现的微生物后，获得了疑似致病性微生物的最终列表。接下来，根据物种特异性序列数(SSRN)、基因组覆盖率(%)和深度深进行分析。结核分枝杆菌复合体使用的是属特异性序列数而不是种特异性序列数（SSRN），因为结核分枝杆菌复合体成员表现出>99.99%的基因组序列相似性。通过查询文献，当致病性与临床表现一致时，确定可能的致病微生物；并使用传统方法(血清学检测、涂片、培养和/或聚合酶链反应测定)对其进行验证。单纯疱疹病毒(HSV)、水痘带状疱疹病毒（VZV）、Epstein-Barr病毒（EBV）和巨细胞病毒（CMV）在非病毒感染患者中视为mNGS假阳性。常见的细菌性脑膜炎病原体(肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌和脑膜炎奈瑟菌)在非细菌性脑膜炎患者中视为mNGS假阳性。烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉和土曲霉在无CNS曲菌病的患者中被视为mNGS假阳性。
2006年CID文章 脑膜/脑病原临床诊断标准
2.4 统计学分析
连续数据被认为是非参数的。定量变量用中位数(范围)表示，定性变量用百分数表示。我们绘制了受试者工作特性曲线（ROC）来比较诊断试验；试验的准确性用曲线下面积(AUC)表示，因此较大的面积意味着更好的准确性。数据处理使用SPSS统计版本21.0 (IBM公司，阿蒙克，纽约，美国)。【组件比较用啥统计学方法？】
3. 结果
3.1 病人特征
在六所医院最终纳入了213个病人，包括与75个被认为是病毒性脑炎/脑膜炎的病人，被认为是TBM 的44个病人，43个细菌性脑膜炎，18个真菌性脑膜炎，33个非感染性中枢神经系统疾病(图1)。所有感染性脑炎/脑膜炎患者被一个调查员(X.-W. X.)筛选出来并确定诊断分类。大部分患者(178/213，83.57%)在解放军总医院第一医疗中心就诊。非感染性中枢神经系统疾病包括脑膜癌(6/33，18%)、与结缔组织病相关的脑病(6/33，18.18%)、代谢性脑病(5/33，15.15%)和其他非感染性疾病(16/33，48.48%)。临床资料见表1。
表1 213个病人的人口学特征及临床特征
3.2 使用mNGS诊断病毒性脑炎/脑膜炎
75例病毒性脑炎和/或脑膜炎患者(54例明确confirmed和21例可能probable)被纳入。如果CSF样本中SSRNs≥1、2、3、5或10时mNGS结果判定为阳性，病毒性脑炎和/或脑膜炎的诊断概率一致性分别为32%、30.7%、29.3%、26.7%和22.7%。阴性一致性率分别为84.8%、89.1%、89.9%、89.9%、92.8%；总符合率分别为66.2%、68.5%、68.5%、67.6%、68.1%。5个mNGS阳性标准的AUC分别为0.584、0.599、0.596、0.583、0.577。当SSRN≥2为mNGS阳性时，对应的AUC(0.599)相对大于其他SSRNs。对于54例明确的病毒性脑炎/脑膜炎患者，如果SSRN≥2为阳性，则AUC最大(0.659，95%置信区间[CI] = 0.566-0.751；图2A)；阳性、阴性、总一致率分别为42.6、89.1、76.0%(表2、表S1)。【ROC曲线这样做，活久见；对于54例明确诊断的患者AUC又是啥？】
表2 54例明确诊断和其余样本构成的数据集中，不同诊断标准的“AUC”及其他诊断性能指标
图2 mNGS阳性率及与传染金标准结果比较（图B1中Xpert只测了31例因此最左边Xpert的阳性率分母为31）
3.3 使用mNGS诊断TBM
44例患者被诊断为TBM(6例明确，38例可能)。如果CSF样本的属特异性序列数（GSRN）≥1、2、3、5和10时mNGS结果为阳性，则阳性率分别为27.3%、20.5%、18.2%、13.6%和6.8%。阴性符合率分别为96.4%、97.6%、98.2%、99.4%、100%；总符合率分别为82.2%、81.7%、81.7%、81.2%和80.8%。当属特异性读数（GSRN）≥1被认为是阳性时，AUC (0.619, 95% CI = 0.516-0.721)最大。6例明确TBM患者(其中Xpert MTB/RIF阳性5例，神经组织抗酸染色阳性1例)mNGS的敏感性和特异性分别为66.67%(4/6)和96.45%(163/169)。44例推定TBM患者中(6例明确，39例可能38例可能)，CSF Xpert MTB/RIF阳性率为16.13% (5/31)，mNGS阳性率为27.27%(12/44)(表S2)；合并mNGS和Xpert MTB/RIF阳性率为29.55%(13/44)(图2B1)。不幸的是，所有脑脊液样本的耐酸杆菌染色和结核分枝杆菌培养结果均为阴性。
3.4 mNG诊断细菌性脑膜炎
43例患者被诊断出细菌性脑膜炎（15例确诊，28例可能）。如果SSRN ≥2、3、5、10和15，则认为mNGS结果为阳性。阳性一致性率分别为62.8％，62.8%、55.8%、55.8%和51.2％。阴性一致率分别为82.9％，87.6%、95.9%、95.9%和95.9％；总一致性率分别为78.9％，82.6%、87.8%、87.8%和86.9％。五个阳性mNGS标准的AUC分别为0.729、0.752、0.758、0.758和0.735。当SSRN≥5或10被认为是阳性时，AUC（0.758，95％CI = 0.663–0.854）最大。 mNGS在15例确定性细菌性脑膜炎患者中的敏感性，特异性，阳性预测值和阴性预测值分别为73.3%、95.9%、61.1%和97.6％（表S3），AUC最大（0.846、95 ％CI = 0.711–0.981）。简而言之，在43名假定的细菌性脑膜炎患者中（15例确诊，28例可能），mNGS在24例中鉴定出细菌病原体（55.8％，24/43）。而CSF革兰氏染色/培养阳性率之和仅为32.56％（14/43）。两种方法的组合将阳性率提高到62.79％（27/43）（图2 B2）。在24例mNGS结果阳性（SSRN≥5或10）的患者中，排名前三位的病原体是肺炎链球菌（41.7％，10/24），肺炎克雷伯菌（12.5％，3/24）和单核细胞增生性李斯特菌（8.3 ％，2/24）。值得注意的是，在非细菌性脑膜炎患者中，mNGS的假阳性率为4.1％（7/170），其中包括金黄色葡萄球菌（57.1％，4/7），肺炎链球菌（28.6％，2/7），和流感嗜血杆菌（14.3％，1/7）。
3.5 mNGS诊断真菌性脑膜炎
在13例确诊的隐球菌性脑膜炎患者中，脑脊液印墨染色和真菌培养的首次阳性率分别为0%和38.4%。经多次染色/培养，两种方法阳性率为84.62%。所有(12/12)脑脊液样本均检出隐球菌抗原。当SSRN≥2被认为是mngs阳性时，其敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为76.92%(10/13)、99.52%(1/207)、90.91%(10/11)和98.56%(206/209)(表S4)。此外，在13例患者中，有5例同时感染了新生隐球菌和gattii隐球菌，另一篇文献有相关详细报告。在5例确诊的脑曲菌病患者中，当SSRN≥2被认为是mngs阳性时，其敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为80%(4/5)、79.3%(165/208)、8.5%(4/47)和99.40%(165/166)(表S5)。
3.6 mNGS诊断四类CNS感染
病毒性脑炎/脑膜炎、TBM、细菌性脑膜炎、真菌性脑膜炎四种明确或可能的感染性脑炎/脑膜炎的mNGS阳性率为40.6%(73/180)(表3)。四种明确的CNS感染性疾病的阳性率为57.0%(52/93)。
表3 四种感染的mNGS结果汇总
4. 讨论
我们探讨了mNGS与常规微生物检测相结合是否有助于感染性脑炎和脑膜炎的诊断。所有患者均符合明确或可能诊断为中枢神经系统感染的标准。我们做了两个重要的观察。首先，由于基因组序列和习性的差异，不同病原的中枢神经系统感染有不同的阳性诊断标准。第二，与传统方法相比，mNGS对中枢神经系统感染的检测更有效(图2B)。此外，mNGS与传统的微生物检测相结合，改善了对中枢神经系统感染的检测。
在75例推定的脑炎和/或脑膜炎患者(54例明确，21例可能)中，通过mNGS鉴定的病原体均为DNA病毒(主要为HSV-1、HSV-2和水痘带状疱疹病毒)，这与其他研究结果一致。然而，肿瘤和HSV感染均可引发自身免疫性脑炎。因此，在病毒性脑炎和/或脑膜炎组中，所有疑似自身免疫性疾病的患者都被排除在外。识别特定的病毒性脑炎/脑膜炎病原体是困难的；作为金标准的特异性病原体聚合酶链反应检测未能识别许多感染性中枢神经系统的病毒家族。理论上，mNGS对临床样本中所有病原体的检测都是有用的。我们发现mNGS不能显著预测病毒性脑炎/脑膜炎(0.5 < AUC < 0.7)，这可能部分归因于RNA检测的缺失。RNA病毒，如肠病毒和日本脑炎病毒，是病毒性脑炎和脑膜炎的常见病因。因此，必须改进DNA/RNA共提取方法，同时对DNA和RNA进行测序，以提高病毒的检出率。
2017年，全球新增结核病病例1000万例，其中55.8万例耐利福平。虽然所有结核感染中只有1%涉及中枢神经系统，但结核性脑膜炎是结核最严重的表现形式；超过50%的患者致残或死亡。然而，TBM的早期准确诊断仍然具有挑战性，这极大地影响了患者的预后。病原复合体称为结核分枝杆菌复合体；本研究检测到结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、牛分枝杆菌和卡内蒂分枝杆菌。因此，mNGS在TBM诊断方面具有很大的实用价值，至少有一个特定的序列与结核分枝杆菌复合物相匹配，这与之前的研究结果一致。虽然mNGS对TBM的诊断效用不高(0.619)，但在当前诊断困境下，mNGS无疑是非常有用的。值得注意的是，mNGS在结核性脑膜炎诊断中的特异性为96.4%，这使得阴性mNGS检测可以作为排除结核性脑膜炎的诊断方法之一。
细菌性脑膜炎在世界范围内是相当大的负担，与高水平的发病率，死亡率和残疾有关。 肺炎链球菌，脑膜炎奈瑟氏球菌，流感嗜血杆菌和单核细胞增生李斯特菌是社区获得性化脓性脑膜炎的最常见病原体。 我们发现肺炎链球菌是本研究的主要致病菌。 当SSRN≥5或10被认为是阳性时，就细菌性脑膜炎的诊断而言，mNGS性能最佳（AUC = 0.846）； 在这种情况下，mNGS可能非常有用。 但是，金黄色葡萄球菌是非常常见的病原体，如果存在于CSF中，可能会导致假阳性结果。
我们发现，mNGS对隐球菌性脑膜炎的诊断实用性比传统方法（印度墨水染色，培养和隐球菌抗原检测）的实用性差。 厚的隐球菌荚膜可能没有被适当地破坏，DNA无法脱出。 细胞壁破裂必须改善。 我们发现有五名患者同时感染了新型隐球菌和gattii隐球菌，因此需要延长抗真菌治疗的疗程。 脑脊液的mNGS可用于鉴定隐球菌种类，促进隐球菌脑膜炎的诊断和管理。 组织病理学是脑曲霉病金标准诊断方法。 尽管本研究中脑曲霉菌病的患者很少，但由于mNGS的无创性，我们认为mNGS可以作为脑曲霉病的未来一线诊断方法。
我们分析了mNGS在四种常见感染性脑炎和/或脑膜炎患者中的诊断价值；我们推测mNGS可用于所有感染性中枢神经系统疾病的诊断，包括那些由罕见或新病原体引起的疾病。mNGS在感染性脑炎/脑膜炎的诊断方面优于常规方法，特别是在物种鉴定方面。然而，这种新的方法应该与传统的微生物测试结合使用。根据病原体的不同，对数据的解释应该有所不同。
我们的研究有一些优势。 主要优势在于，我们将符合条件的患者分为具有不同CNS感染的组，而不是合并所有具有CNS感染的患者。 参照不同类型的感染来解释mNGS结果。 而且，该研究本质上是前瞻性的。 但是，这项研究也有一些局限性。 首先，RNA未与DNA测序同时进行测试，这可能会漏掉有价值的补充信息。 此外，由于DNA提取效率对mNGS结果至关重要，因此在以后的研究中必须对各种试剂盒的提取效率进行比较。 最后，我们的样本量相对较小，尤其是根据感染类型对患者进行分层之后。
mNGS作为一种新型的微生物检测方法，在检测感染性脑炎和脑膜炎病原体方面具有传统检测方法无法比拟的优势。这项新技术显示出很大的潜力。在DNA和RNA共提取方法、提取效率、定植与感染的区分以及方法标准化方面需要谨慎关注。
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