更多请了解Cufflinks: http://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks/
图片来自上面的网址，cufflink workflowCufflinks 利用Tophat比对的结果（alignments）来组装转录本，估计这些转录本的丰度，并且检测样本间的差异表达及可变剪接。
这个软件其实是个套装，包括四个部分分别命名为：cufflinks、cuffcompare、cuffmerge及cuffdiff.
流程：
第一步，利用tophat/bowtie比对结果（bam格式）及参考基因组构建转录本，最终的转录本是以gtf格式保存的。
第二步，Cuffcompare主要是对两个或多个转录本集合中转录本相似情况的比较，例如将第一步构建出的转录本与ENSEMBL数据库中的转录本进行比较，评估转录本构建情况，此外，根据构建的转录本与已知ENSEMBL数据库中的转录本的相对位置定义了一系列分类，例如内含子区域、反义、基因间区域转录本等等近10种分类。
第三步，cuffmerge是将多个转录本集合合并成一套转录本集合，例如将在多个组织样本中构建的多套转录本合并成一套转录本，cuffmerge能够很好地完成去除冗余。
第四步，cuffdiff衡量两个或多个样本间差异表达的基因，例如癌症与正常组织间差异表达的转录本，此外还能衡量差异可变剪接体。
至此，转录本测序常规数据分析基本结束，接下来进行实验验证或深入数据分析。
具体实例：
Mapping完了以后，cufflinks就可以把map到基因组里的序列组装成一个转录组了，这个转录组理论上包含了所有当时细胞里的所有mRNA，组装好的转录组包含了可能的剪切信息和所有转录的表达量，这个表达量是根据map到基因组的序列的总数和每个转录片断的长度进行归一化的，听起来比较难懂，它是对于在转录片断里的每一千个碱基对，在每一百万个成功map的序列中，map在这一千个碱基对上的序列的比例，
fragments per kilobase of transcript per million mapped fragments (FKPM)。
参考生信菜鸟团：http://www.bio-info-trainee.com/166.html
详细使用参照：http://blog.sina.com.cn/s/blog_751bd9440102v72b.html
[ Cufflinks输出结果
cufflinks的输入文件是sam或bam格式。并且sam或bam格式的文件必须排好序。（The SAM file supplied to Cufflinksmustbe sorted by reference position.）Tophat的输出结果sam或bam已经排好了序。针对其他的未排序的sam或bam文件采用如下排序方式：
sort -k 3,3 -k 4,4n hits.sam > hits.sam.sorted
1. transcripts.gtf
该文件包含Cufflinks的组装结果isoforms。前7列为标准的GTF格式，最后一列为attributes。其每一列的意义：
列数 列的名称 例子 描述
1 序列名 chrX 染色体或contig名; 2 来源 Cufflinks 产生该文件的程序名; 3 类型 exon 记录的类型，一般是transcript或exon; 4 起始 1 1-base的值; 5 结束 1000 结束位置; 6 得分 1000 ; 7 链 + Cufflinks猜测isoform来自参考序列的那一条链，一般是'+','-'或'.';8 frame . Cufflinks不去预测起始或终止密码子框的位置; 9 attributes ... 详见下
每一个GTF记录包含如下attributes：
Attribute 例子 描述
gene_idCUFF.1Cufflinks的gene id;transcript_idCUFF.1.1 Cufflinks的转录子 id; FPKM 101.267 isoform水平上的丰度,FragmentsPerKilobase of exon model perMillion mapped fragments; frac 0.7647 保留着的一项，忽略即可，以后可能会取消这个;conf_lo 0.07 isoform丰度的95%置信区间的下边界，即 下边界值 = FPKM * ( 1.0 - conf_lo );conf_hi 0.1102 isoform丰度的95%置信区间的上边界，即 上边界值 = FPKM * ( 1.0 + conf_hi ); cov 100.765 计算整个transcript上read的覆盖度;full_read_support yes 当使用 RABT assembly 时，该选项报告所有的introns和exons是否完全被reads所覆盖
2. ispforms.fpkm_tracking
isoforms(可以理解为gene的各个外显子)的fpkm计算结果
3. genes.fpkm_tracking
gene的fpkm计算结果Cuffmerge简介
Cuffmerge将各个Cufflinks生成的transcripts.gtf文件融合称为一个更加全面的transcripts注释结果文件merged.gtf。以利于用Cuffdiff来分析基因差异表达。
2. 使用方法
$ cuffmerge [options]*
输入文件为一个文本文件，是包含着GTF文件路径的list。常用例子：
$ cuffmerge -o ./merged_asm -p 8 assembly_list.txt
3. 使用参数
-h | --help
-o default: ./merged_asm
将结果输出至该文件夹。
-g | --ref-gtf将该reference GTF一起融合到最终结果中。
-p | --num-threads defautl: 1
使用的CPU线程数
-s | --ref-sequence /该参数指向基因组DNA序列。如果是一个文件夹，则每个contig则是一个fasta文件；如果是一个fasta文件，则所有的contigs都需要在里面。Cuffmerge将使用该ref-sequence来帮助对transfrags分类，并排除repeats。比如transcripts包含一些小写碱基的将归类到repeats. ]
4. Cuffmerge输出结果
输出的结果文件默认为 /merged.gtf
<1>命令：cufflinks -p 4 -o test_cuff /home/andengdi/lyr/rna-seq/02-align_out/test_output/accepted_hits.bam
流程及结果
5 为了得到匹配到的序列，将gif文件中的序列提取出来。
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