A Pan-Cancer Bioinformatic Analysis of RAD51 Regarding the Values for Diagnosis, Prognosis, and Therapeutic Prediction
RAD51在诊断、预后和治疗预测方面的价值的泛癌症生物信息学分析
发表期刊：Front Oncol
发表日期：2022 Mar 10
DOI: 10.3389/fonc.2022.858756
一、背景
癌症产生于突变。基因组的不稳定性和突变被认为是癌症的标志。在非癌细胞中，同源重组（HR）对维持基因组的稳定性至关重要。HR通过DNA序列的互补性来修复大多数DNA病变。HR修复的一个关键步骤是单链DNA（ssDNA）与修复部位附近的RAD51蛋白结合。这一过程已被发现在一些癌症类型的肿瘤发生中至关重要。
一项早期的临床研究表明，对于肺癌患者RAD51的过表达会导致患者的生存率明显降低，这推断出RAD51对癌症患者的潜在预后价值。数据表明，RAD51的过度表达可能会促进癌症对化疗和放疗的抵抗。
二、材料与方法
1.数据来源
从癌症基因组图谱（TCGA）、基因型-组织表达（GTEx）和中国胶质瘤基因组图谱（CGGA）下载了胶质瘤队列的临床和基因组数据
2.实验流程
1）突变分析：突变分析使用cBioPortal和Open Targets Platform进行
2）RNA-Seq数据分析和绘图：ROC图、生存KM图、nomogram
3）多重数据过表达分析：使用Oncomine对RAD51的基因过表达和DNA拷贝数增加的多个数据集进行了访问和分析
4）RAD51相关基因的富集分析：使用GEPIA确定了前100个RAD51相关的基因；使用STRING构建前100个RAD51相关基因的蛋白-蛋白相互作用网络
5）癌细胞的免疫荧光染色：RAD51在A431鳞癌细胞、U-2 OS骨肉瘤细胞和GBM细胞的细胞核、内质网（ER）和微管中的亚细胞分布的免疫荧光染色来自人类蛋白质图谱（HPA）
6）免疫组化染色：癌症和非癌症组织中RAD51的免疫组化染色图像从HPA中获取
7）细胞周期关联分析：使用HPA访问和分析了FUCCI U-2骨肉瘤细胞系的单细胞RNA测序数据的图表
8）干性和突变水平分析：OCLR算法被用来计算评估癌症干性的mRNAsi；肿瘤突变负担（TMB）和微卫星不稳定性（MSI）被用来评估样本的突变水平
9）使用TCGA数据和TISIDB分析了不同癌症类型的RAD51的免疫调节剂关联以及RAD51表达与人类癌症免疫亚型之间的关联
10）免疫细胞浸润分析：XCELL
11）单细胞测序数据的获取和分析：使用TISCH对单细胞数据进行了访问和分析
12）免疫治疗预测：在多种癌症类型中对RAD51低组（0-25%）和高组（75-100%）的免疫检查点阻断（ICB）进行了比较；使用TIDE算法来预测潜在的ICB反应
13）药物敏感度分析：GSCALite被用来评估药物的剂量反应曲线下面积（AUC）值和不同癌症细胞系中RAD51的基因表达谱
14）化疗预测：使用ROC分析了乳腺癌、卵巢癌、胶质瘤（女性）和结肠癌（非化疗）队列中的RAD51转录组水平与治疗反应的关联
三、实验结果
01 - 癌症中RAD51的突变
首先探讨RAD51基因的改变是否与癌症有关。改变频率柱状图显示，大多数癌症类型的总改变频率都低于2.5%，只有宫颈腺癌、胸膜间皮瘤、成熟B细胞肿瘤和子宫内膜癌的改变频率超过2.5%，但除了子宫内膜癌，这些癌症类型的病例数都比较少（图1A）。生存数据表明，RAD51的改变导致癌症患者的总生存率降低，但改变组的病例数相对较少，P值也相对较大（图1B）。为了进一步研究RAD51在癌症中的突变，将TCGA的突变数据绘制出来，只发现48个突变，其中46个错义突变和2个截断突变（图1C），如3D蛋白结构所示（图1D）。还从Uniprot数据库收集了变异数据，发现了10个疾病相关的变异，但只有一个变异与癌症有关（图1E）。基于这些结果，这项研究表明，作为一个维持基因组稳定性的重要蛋白，RAD51的基因改变频率很低。因此，RAD51的基因改变可能不是导致癌症的主要原因。
图1 泛癌中RAD51的基因改变
02 - RAD51对各种癌症的价值
尽管研究假设RAD51的基因改变可能不是驱动癌症的主要原因，但RAD51的表达可能与癌症有关。本研究使用TCGA和GTEx数据比较了所有肿瘤类型和正常组织中RAD51的表达，以确定RAD51在癌症中的过度表达。结果显示，RAD51在28种类型的癌症中明显过表达。间皮瘤（MESO）和葡萄膜黑色素瘤（UVM）没有可比较的正常组织，而急性骨髓性白血病（LAML）是唯一的RAD51在癌组织中表达低于正常组织的癌症类型（图2A）。为了在更好的控制下进一步比较癌症-非癌样本，研究还比较了来自同一患者的可用癌症类型的配对癌症非癌样本。结果显示，发现15种癌症类型的RAD51明显过表达（图2B）。RAD51的基因表达谱在所有肿瘤样本和配对的女性和男性正常组织中的解剖图显示，RAD51在大多数器官的癌症中过表达（图2C）。为了评估RAD51在这28种明显过表达的癌症中的诊断价值，除了胆管癌（CHOL）、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤（PCPG）和子宫肉瘤（UCS）因为正常组织数量少之外，对这些癌症类型绘制了诊断ROCs。结果显示，15种癌症类型的AUCs超过0.9，5种癌症类型的AUCs在0.8-0.9之间，3种癌症类型的AUCs在0.7-0.8之间（图2D）。这些结果表明，RAD51对18种癌症类型有很好的诊断价值，对3种癌症类型有可接受的诊断价值。
图2 泛癌中RAD51的诊断价值
为了验证RAD51在癌症中的诊断价值，利用Oncomine分别对不同癌症类型的RAD51表达或DNA拷贝数进行跨分析比较。结果显示，膀胱尿道癌（BLCA）、乳腺浸润癌（BRCA）、宫颈鳞状细胞癌和宫颈内膜腺癌（CESC）。淋巴肿瘤弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBC）、结肠腺癌（COAD）、食道癌（ESCA）、脑瘤（GBM&LGG）、头颈部鳞癌（HNSC）、肝细胞癌（LIHC）、卵巢浆液性囊腺癌（OV）、肺癌（LUAD&LUSC）、前列腺腺癌（PRAD）、皮肤黑色素瘤（SKCM）和胃腺癌（STAD）在某些分析中有显著的RAD51过度表达或RAD51 DNA拷贝数增加。这些数据验证了RAD51在上述大多数癌症类型中的诊断价值。为了研究RAD51在蛋白水平上的表达，比较了15种组织类型中癌症和非癌症组织的RAD51蛋白染色。代表性的图像显示，13种组织类型在癌症中的RAD51染色信号强于非癌症组织。睾丸癌有强烈的RAD51染色，但正常睾丸组织的一些细胞成分也有强烈信号。在淋巴结中，高级别非霍奇金型淋巴瘤的RAD51信号与正常淋巴结一样强，但低级别非霍奇金型和霍奇金型淋巴瘤的RAD51信号较弱（图3）。
图3 癌症和正常组织中RAD51的代表性蛋白染色图像
03 - RAD51在癌症中的预后价值
作者还对RAD51在癌症中的预后价值感兴趣。因此，在33种癌症类型中进行了RAD51的单变量总生存率Cox回归分析。结果显示，在11种癌症类型中，RAD51与较差的总生存率显著相关，而在直肠腺癌（READ）和胸腺瘤（THYM）中RAD51与较好的总生存率相关（图4A）。在Cox回归中还使用了高（50-100%）和低（0-50%）RAD51患者的KM图和对数秩分析，以进一步观察RAD51与患者总生存的关联。高和低RAD51患者的KM图显示，有9种癌症类型仍然显著（图4B）。为了评估RAD51在11种癌症中的预后价值，RAD51与较差的总生存期明显相关，绘制了与时间有关的预后ROCs。结果显示，肾上腺皮质癌（ACC）、肾脏嗜铬细胞癌（KICH）、间皮瘤（MESO）和前列腺腺癌（PRAD）的AUCs超过0.8。肾脏乳头状细胞癌（KIRP）、脑低级胶质瘤（LGG）、胰腺癌（PAAD）和嗜铬细胞瘤和副神经节瘤（PCPG）的AUCs超过0.7（图4C）。这些结果表明，RAD51对5种癌症类型有很好的预后价值，对4种癌症类型有可接受的预后价值。
图4 泛癌中RAD51的预后价值
04 - RAD51在癌症中的潜在功能
为了预测RAD51在癌症中的潜在作用，鉴定了RAD51相关的表达基因。使用STRING构建了一个蛋白质-蛋白质相互作用网络，以显示RAD51和这些基因的潜在联系（图5A）。在富集研究中进一步分析了前100个相关的基因。GO生物过程富集结果显示，RAD51主要与细胞周期相关如“DNA复制”、“DNA修复”和“细胞分裂”（图5B）。KEGG路径富集显示，"细胞周期 "是最富集的路径（图5C）。此外，本研究还利用GSEA 分子特征数据库进行了免疫学特征富集分析（图5D）。对RAD51在A431鳞癌细胞、U-2 OS骨肉瘤细胞和GBM细胞的细胞核、内质网（ER）和微管内的亚细胞分布的免疫荧光染色显示，RAD51主要在核小体边缘表达，这说明它与细胞周期有关（图5E）。以U-2 OS骨肉瘤细胞系的细胞周期为例，观察RAD51在细胞周期中的表达变化。结果显示，RAD51在细胞周期的早期阶段不断提高，大约9小时后开始恢复。因此，S-tr期表达的RAD51最高（图5F）。细胞周期中RAD51的改变进一步表明它在调节癌细胞周期中的关键作用。此外，还分析了RAD51与癌症干性、TMB和MSI在不同的癌症类型中的相关性。结果显示，RAD51与27种类型的癌症的干性呈正相关。在这些癌症类型中，RAD51与8种癌症类型的干性密切相关，如乳腺浸润癌（BRCA）、食道癌（ESCA）、肺癌（LUAD&LUSC）和胃腺癌（STAD）（图5G）。在TMB和MSI分析中，除了6种癌症类型的TMB与RAD51水平呈弱相关外，大多数癌症类型与RAD51水平不相关（图5H-I）。
图5 RAD51在癌症中的潜在功能
05 - 癌症中RAD51与免疫的关系
RAD51和免疫调节剂的相关分析结果显示，RAD51可能与不同癌症类型的多种免疫调节剂有关。在甲状腺癌（THCA）和肾脏透明细胞癌（KIRC）中，RAD51与大多数免疫调节剂呈正相关。在食道癌（ESCA）和多形性胶质母细胞瘤（GBM）中，RAD51与大多数免疫抑制因子、免疫刺激因子和趋化因子受体呈负相关。RAD51与多种癌症类型中的许多MHC分子呈负相关。在肝癌（LIHC）和低级别胶质瘤（LGG）中，RAD51也与大多数MHC分子呈正相关。因此，这项研究表明RAD51可能与这些癌症类型的免疫调节有关。从相关性的另一个维度来看，KDR、CCL14、CXCL12、IL6R、TNFSF13和CX3CR1在多种癌症类型中与RAD51呈负相关，而LAG3、CD276、MICB、ULBP1、TAP1和TAP2在大多数癌症类型中与RAD51呈正相关，表明这些分子可以成为RAD51在不同癌症类型中的潜在免疫治疗靶点（图S2）。
图S2 跨癌症类型的 RAD51 的免疫调节剂关联
为了研究RAD51是否能潜在地影响癌症的免疫亚型，本研究还分析了RAD51的表达与人类癌症的免疫亚型之间的关联。结果显示，在11种癌症类型中，RAD51的表达在不同的免疫亚型中具有明显的差异。在大多数癌症类型中，C3（炎症）免疫亚型的RAD51表达低于其他免疫亚型（图S3）。因此，RAD51可能是这些癌症类型中炎症免疫亚型的排除性生物标志物。
图S3 人类癌症中RAD51表达与免疫亚型的关系
为了进一步研究RAD51和癌症免疫微环境的关系，使用XCELL算法估计了免疫细胞浸润水平。RAD51和免疫细胞浸润水平的相关分析显示，在一些癌症类型中，RAD51可能与癌症免疫微环境密切相关。在22种癌症类型中，RAD51与基质分数呈负相关。LGG是唯一一个其基质得分与RAD51弱正相关的癌症类型。对于微环境得分，RAD51与14种癌症类型的得分呈负相关，而在3种癌症类型中，RAD51与微环境得分呈正相关。另一方面，在6种癌症类型中，RAD51与免疫分数呈正相关，但在9种癌症类型中，RAD51与免疫分数呈负相关。详细来说，除了T细胞CD4+（Th1和TH2）和普通淋巴祖细胞得分外，RAD51与大多数XCELL得分呈负相关，在大多数癌症类型中，RAD51与T细胞CD4+ Th1、T细胞CD4+ TH2和普通淋巴祖细胞得分呈正相关，特别是T细胞CD4+ TH2在大多数癌症类型中与RAD51强烈相关。在5种癌症类型中，RAD51与大多数XCELL评分呈强负相关，而在3种癌症类型中，RAD51与大多数XCELL评分呈强正相关。最引人注目的是，在胸腺瘤（THYM）中，大多数免疫细胞得分与RAD51呈强正相关，但大多数基质细胞得分与RAD51呈强负相关（图S4）。
图S4 RAD51表达与免疫细胞浸润水平的相关性
由于上述大多数分析表明，癌症中的RAD51水平与免疫细胞，特别是T细胞有关，为了进一步了解RAD51在组织样本中的分布，作者收集并探讨了单细胞表达数据，用来比较多种癌症类型中不同细胞类型（包括癌细胞和非癌细胞）的RAD51表达。结果显示，在分析的大多数癌症样本中，增殖T细胞是表达最高RAD51的细胞类型。这些结果解释了之前的结果，即RAD51与T细胞的活动密切相关（图S5）。
图S5 多个单细胞数据集中泛癌样本中不同类型单细胞中RAD51平均表达的热图
本研究根据RAD51亚队列的反应结果预测能力和总生存期，将RAD51表达与标准化生物标志物进行比较，评估了RAD51的生物标志物相关性。结果显示，在23个ICB亚群中的12个中，RAD51表达的AUCs超过0.5。数据表明，RAD51的预测价值甚至高于TMB、T.Clonality和B.Clonality。然而，RAD51的预测价值与MSI评分相似，后者在12个ICB亚群中的AUC值超过0.5，但RAD51的预测价值低于CD27A、TIDE、IFNG和CD8（图S6A）。为了进一步评估RAD51对临床免疫治疗的价值，本研究比较了不同癌症类型中RAD51低（0-50%）和高（50-100%）样本的免疫检查点阻断（ICB）反应。潜在的ICB反应是用肿瘤免疫功能紊乱和排斥（TIDE）算法预测的。计算结果显示，9种癌症类型的TIDE在RAD51高组和低组之间存在明显差异（图S6B）。这些结果表明，在甲状腺癌（THCA）、肺腺癌（LUAD）、肝脏肝细胞癌（LIHC）、整体胶质瘤和肾脏肾透明细胞癌（KIRC）中，RAD51表达较低的患者更容易对ICB免疫疗法产生反应。因此，RAD51可以成为这些癌症类型中ICB治疗的预测因素。
图S6 RAD51对肿瘤免疫治疗的预测价值
05 - RAD51对肿瘤药物治疗的预测价值
通过Spearman相关分析，RAD51的表达与GDSC和CTRP数据库中多种抗癌药物的药物敏感性（IC50）进行了对比。将GDSC和CTRP中的癌症细胞系的药物敏感性和基因表达谱数据整合起来进行研究。结果显示，RAD51的表达与大多数药物的敏感性呈负相关。在GDSC中，NPK76-II-72-1、PIK-93和Vorinostat是前三名最负相关的药物，而Trametinib是唯一正相关的药物(图S7A)。在CTRP中，几乎所有药物的敏感性都与RAD5呈负相关(图S7B)。这些数据表明，RAD51可以成为预测药物治疗的生物标志物。此外，本研究还通过绘制四种癌症类型中RAD51在反应者和非反应者中的表达量、化疗预测ROC图和RAD51四分位数表达组中的化疗反应，分析了RAD51与化疗的关联。结果显示，在乳腺浸润癌（BRCA）和结肠腺癌（COAD）中，化疗应答组的RAD51表达分别低于无应答组。然而，在卵巢浆液性囊腺癌（OV）和多形性胶质母细胞瘤（GBM）中，化疗应答组的RAD51表达量高于无应答组（图S7C）。这些数据表明，RAD51具有潜在的化疗预测价值，但预测模式可能因不同的癌症类型而不同。
图S7 RAD51对肿瘤药物治疗的预测价值
06 - RAD51在胶质瘤整体预后中的应用
为了证明RAD51的临床应用是可行的，本研究将重点放在胶质瘤一种类型上，并制定RAD51在整体胶质瘤预后中的应用策略。RAD51与LGG的生存率明显相关，但与GBM无关。本研究发现，不仅整体胶质瘤的RAD51表达量明显高于正常脑组织，而且高等级胶质瘤的RAD51表达量也明显高于低等级胶质瘤（图S8A）。TCGA（LGG+GBM）胶质瘤总体数据的Sankey图显示，RAD51水平可能与患者的生存期有关(图S8B )。RAD51高和低的胶质瘤患者的KM图显示，在TCGA（LGG+GBM）队列（n=332）中，RAD51与总生存期显著相关(图S8C)。对三个独立的外部胶质瘤队列进行了分析，包括CGGA_mRNAseq_693原发（n=404），CGGA_mRNAseq_325原发（n=222），和CGGA_mRNA-array_301原发（n=262）。结果显示，在这三个验证队列中，RAD51高组与RAD51低组相比，其生存率分别明显降低。因此，RAD51在整体胶质瘤中的生存关联得到了证实（图S8D-F）。
图S8 RAD51在整体胶质瘤中的表达
07 - RAD51胶质瘤生存预测模型的构建
为了筛选胶质瘤临床生存预测模型的风险因素，对总生存期和临床变量进行了单变量Cox分析，包括RAD51表达、PRS类型、Grade、性别、年龄、放疗、替莫唑胺（TMZ）治疗、IDH突变、1p19q编码删除和MGMTp甲基化。结果显示，RAD51表达、PRS类型、等级、年龄、IDH突变、1p19q编码缺失和MGMTp甲基化与胶质瘤患者的总生存期显著相关（图6A）。为了排除这些因素的潜在相互关联，对这些变量进行了多变量Cox回归分析。结果显示，RAD51表达、PRS类型、Grade、年龄、TMZ治疗、IDH突变和1p19q编码缺失对胶质瘤的总生存期有明显的独立预测置信度（图6B）。在多变量Cox分析的基础上，构建了预测胶质瘤患者1、3、5年生存率的nomogram（图6C）。1年、3年、5年总生存率的nomogram校准曲线的预测结果与所有患者的观察结果基本一致（图6D）。
图6 RAD51全脑胶质瘤预后模型的构建
四、结论
本研究从多个开放数据库中获取数据，对RAD51的遗传改变、基因表达、生存关联、功能富集、干性、突变关联、免疫关联和药物治疗关联进行了分析，构建了RAD51对整体胶质瘤的预后模型，作为RAD51作为生物标志物的实例应用。总而言之，RAD51是多种癌症类型的临床价值生物标志物，关于其对诊断，预后和治疗预测的潜在作用。
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