Novel prognostic matrisome-related gene signature of head and neck squamous cell carcinoma
头颈部鳞状细胞癌的新型预后基质体相关基因特征
发表期刊：Front Cell Dev Biol
发表日期：2022 Aug 23
影响因子：6.081
DOI: 10.3389/fcell.2022.884590
一、背景
头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是一种常见的恶性肿瘤，来源于口腔、咽部和喉部的粘膜上皮。最常见的HNSCC亚型是喉鳞状细胞癌（LSCC）、口腔鳞状细胞癌（OSCC）和鼻咽癌。LSCC约占所有头颈部恶性肿瘤的20%，是上呼吸道肿瘤中仅次于肺癌的第二大恶性肿瘤。声门上和声门下LSCC的预后普遍较差，且明显差于声门喉癌。由于OSCC具有高度侵袭性，患者在诊断和治疗过程中通常会出现疾病进展。确定LSCC和OSCC的共同分子标志物不仅可以发现这两种疾病之间的关系，而且对它们的诊断和治疗也有重要作用。
细胞外基质（ECM）是一个复杂的网络，由细胞内合成的生物大分子和细胞外分泌的生物大分子组成，驻留在细胞表面或细胞之间。核心基质组包括250多个独特的基质基因，分为胶原蛋白、糖蛋白和蛋白多糖。癌症中的ECM重塑是肿瘤微环境（TME）的重要组成部分，也是恶性肿瘤发展的重要驱动力。ECM的沉积、重塑和交联与肿瘤的发展和预后密切相关。
二、材料与方法
1、数据来源
1） TCGA-HNSC基因表达RNA-Seq数据，包括count 和TPM数据，来自UCSC Xena，并与临床信息相关联（502个HNSCC肿瘤44个正常组织）
2） GEO：GSE27020（109个LSCC样本）、GSE42743（74个OSCC和29个正常样本）、GSE150321、GSE172577
3） 从Matrisome项目中获得了274个核心matrisome基因的列表；共选择了190个常见的核心基质基因，包括33个胶原蛋白、127个ECM糖蛋白和30个蛋白多糖编码基因
2、分析流程
流程图
三、实验结果
01 - 建立基于差异表达的matrisome基因的预后模型
通过对TCGA-HNSC数据进行差异分析，在肿瘤和正常样本之间共发现1779个DEGs，包括939个上调基因和840个下调基因（图2A）。在GO BP分析中，这些DEGs大多富集于 "肌肉结构发育"、"超分子纤维组织"、"骨骼系统发育"、"纤毛运动"、"模式规范过程"和 "细胞外基质组织"（图2B）。在KEGG分析中，DEGs在 "蛋白质消化和吸收"、"唾液分泌"、"ECM-受体相互作用"、"钙信号通路"、"局灶粘附 "和"肥大性心肌病 "中富集。对TCGA-HNSC中的DEGs和190个共同的核心matrisome基因进行交叉分析，确定了52个差异表达的matrisome相关基因用于后续分析（图2C,D）。
图2 筛选DEGs
为了建立HNSCC患者的预后评估模型，选择TCGA-HNSC数据集（仅有生存数据的肿瘤样本，N = 502）作为训练队列，GSE27020（LSCC样本，N = 109）和GSE42743（OSCC样本，N = 74）数据集作为测试队列。对52个差异表达的matrisome基因进行了单变量Cox回归分析，以评估训练队列中样本的OS。将P<0.1的12个基因（MATN3、LAMC2、FN1、SPP1、LAMB4、LAMB3、DMP1、IBSP、DMBT1、TGFBI、CHAD和MMRN1）列入LASSO分析。所有12个matrisome基因都达到了最小的部分表达量，并进一步将其表达水平和预后数据纳入多变量Cox回归分析，以确定参与特征构建的基因。多变量Cox回归分析建立了一个由六个基因（FN1、LAMB4、LAMB3、DMP1、CHAD和MMRN1）组成的风险的预后模型。风险分数的计算公式如下：风险分数=0.075123 × FN1 + (-0.348,219) × LAMB4 + 0.090359 × LAMB3 + 0.363,187 × DMP1 + (-0.314,325) × CHAD + (-0.125,206) × MMRN1。
根据风险评分，训练和测试队列的样本基于50%的截止值被分为两组，即高风险组和低风险组，（图3A-O）。KM分析显示，无论是在训练队列（TCGA-HNSC）还是测试队列（GSE27020和GSE42743）中，高风险评分的患者的生存时间都明显短于低风险组（图3A,F,K）。此外，1年、2年和5年生存率的ROC曲线的曲线下面积（AUC）值分别为0.636、0.635和0.571，表明风险评分可用于预测训练队列（TCGA-HNSC）的预后（图3B）。在测试队列中，1、2、5年生存率的AUC值在GSE27020（图3G）和GSE42743（图3L）中分别为0.724、0.691和0.650。此外，所有六个基因（FN1、LAMB4、LAMB3、DMP1、CHAD和MMRN1）在训练（TCGA-HNSC）和测试队列（GSE27020和GSE42743）中都与预后不良和不健康的生活习惯显著相关（图3E，J，O）。因此，建立并验证了HNSCC的基质相关预后模型。
图3 关键基因的预后分析
02 - 高风险组和低风险组之间的肿瘤浸润免疫细胞图谱比较
作者使用ssGSEA，根据TCGA-HNSC的临床数据和每个样本的风险评分，绘制了23种浸润性免疫细胞类型的热图（图4A），进行了肿瘤浸润性免疫细胞之间的相关性分析。如图4B所示，激活的CD8 T细胞和中性粒细胞之间有最高的明显正相关，而最高的明显负相关是CD56 bright自然杀伤细胞和单核细胞之间。不同风险组之间肿瘤浸润免疫细胞丰度的对比分析显示，高风险组中活化和未成熟的B细胞、嗜酸细胞、巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和Th2细胞的存在明显减少（图4C）。最后，分析了23种浸润性免疫细胞类型与风险评分之间的相关性。结果显示，Th17细胞是唯一与风险评分明显正相关的细胞类型，而风险评分与未成熟B细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、活化B细胞、Th2细胞、γ-δT细胞、MDSCs和中性粒细胞呈明显负相关（图4D）。总之，结果显示7种细胞类型（活化的B细胞、嗜酸细胞、未成熟的B细胞、巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和Th2细胞）可能在基质相关的HNSCC微环境中发挥重要作用。
图4 肿瘤浸润性免疫细胞景观估计
03 - 不同风险组的体细胞突变情况
此外，TCGA-HNSC患者的体细胞突变谱被用来探索高、低风险组的常见体细胞突变。在这些患者中，239人属于高危组，215人属于低危组。与低风险组相比，高风险组的基因突变频率普遍较高。高危组或低危组的突变情况变化如下：在高危评分的组织中，有8个基因突变率大于15%：TP53、TTN、FAT1、CDKN2A、MUC16、CSMD3、NOTCH1和LRP1B，而在低风险组的组织中，有8个基因突变率超过15%：TP53、TTN、FAT1、CDKN2A、MUC16、PIK3CA、CSMD3和SYNE1。值得注意的是，TP53是癌症中最常见的突变基因之一，在高风险组比低风险组出现的频率更高（图5A，B）。
图5 高风险和低风险HNSCC患者之间的突变谱和通路富集景观
04 - 预后基因分析
进行GSVA以确定预后相关的KEGG通路。如热图所示，高危组在P53信号通路、甲状腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、前列腺癌、基底细胞癌和黑色素瘤KEGG通路中明显富集，而糖胺聚糖生物合成硫酸角蛋白、糖基磷脂GPI锚生物合成和叶酸生物合成KEGG通路在低危组明显富集（图5C）。因此，高危组的基因表达在肿瘤相关途径中明显富集。
利用HPA在线数据集，又通过IHC验证了这些预后基因的蛋白表达。与正常对照组相比，发现FN1、LAMB3和DMP1蛋白上调，而LAMB4、CHAD和MMRN1蛋白则下调（图6）。这些发现与使用TCGA数据集的结果一致。
图6 基于HPA的预后蛋白的免疫组化染色
05 - 预后基因的单细胞转录组学分析
接下来，使用GSE150321和GSE172577数据集的单细胞RNA-Seq数据来进一步验证HNSCC的预后模型和基因之间的关系。对于GSE150321数据集，包括来自两个LSCC样本的数据，根据以前的文献，总共确定了5个细胞集群（肿瘤、免疫、上皮、间质和内皮细胞）（图7A），然后计算每个细胞的风险得分，并将其绘制在UMAP图和小提琴图中（图7B）。与非肿瘤细胞相比，LSCC肿瘤细胞的风险得分更高。
对于GSE172577数据集，四个OSCC样本，GSM5258385、GSM5258386、GSM5258387和GSM5258388被合并。根据 "scCancer "R软件包，对细胞集群进行了手工注释（图7C,D）。值得注意的是，除了在GSE172577中CHAD的表达水平较低外，大多数预后基因的表达情况与LSCC相似（图7E）。总的来说，这些结果进一步支持了这个与matrisome相关的预后基因的特征影响了HNSCC的进展。
图7 基于单细胞测序分析的预后性表达谱
06 - LAMB4影响肿瘤细胞的增殖和迁移
根据前面的分析结果，作者选择LAMB4作进一步分析，因为它是六个预后基因之一，在HNSCC方面的研究较少。在AMC-HN-8和JHU011细胞系中，使用LAMB4的siRNA来沉默LAMB4的表达（图8A）。CCK-8试验表明，沉默的LAMB4水平促进了AMC-HN-8和JHU011细胞的增殖（图8B）。还检测了LAMB4沉默后的迁移变化。转孔实验显示，LAMB4敲除后促进了LSCC和OSCC细胞系的迁移（图8C,D）。因此，作为一个潜在的肿瘤抑制基因，沉默LAMB4促进了HNSCC细胞系的增殖和迁移。
图8 在HNSCC细胞系中沉默LAMB4可促进细胞增殖和迁移
四、结论
综上所述，作者揭示了matrisome相关基因的表达与HNSCC的生存有关，并建立了一个基于六个差异表达的matrisome相关基因（FN1、LAMB4、LAMB3、DMP1、CHAD和MMRN1）特征的新型风险评分预后模型，这些基因也可能作为HNSCC的潜在治疗目标。
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