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DNA重组概述

重组的概念及意义

1、DNA重组的概念

DNA重组是由不同DNA链的断裂和连接而产生的DNA片段的交换和重新组合，形成新的DNA分子的过程，新的DNA分子含有原来两个DNA的片段。DNA重组是由细胞编码的酶催化的一个必要的细胞过程，DNA重组不仅发生在减数分裂的过程中，而且发生在体细胞中。从原始的生物如病毒到高等动植物中都发生DNA重组，因此所有的DNA都是重组DNA。基因工程中的DNA体外改造和连接所引起的基因表达变化，只是模仿大自然在进化的过程中进行的重组和突变。

2、DNA重组的意义

1）DNA重组引起进化：可以为生物增添更加适应环境的基因组合，并通过研究阐明进化机制

2）引起DNA序列上的一些变化，可以调节基因的表达。

3）可以修复DNA损伤或复制障碍

4）进行基因标记，检测突变基因的位置和分离突变基因

5）掌握DNA重组的机制为基因工程技术提供理论基础

3、DNA重组的类型

同源重组、位点专一性重组和转座重组

同源重组（homologous recombination）

1、概念

同源重组是两条具有同源序列的DNA靠近时所发生的DNA交换。这个现象广泛存在于生物界。

例如真核生物在减数分裂时期，姐妹染色单体间遗传物质发生交换。细菌的同源重组发生在接合过程中，交配的染色体在两个紧密接触的细胞中转移。重组修复中也发生同源重组。

减数分裂时期的DNA重组

2、同源重组的特点

要求较大的同源DNA片段（>75bp）才能交换，同时需要重组酶（RecA）的参与。同源片段形同或者相近，在任何位点均可以发生重组，但存在重组热点。整个基因组重组的频率不恒定，受综合效应和局部效应的影响，其中卵母细胞>精母细胞。女性联会复合体的长度以及重组频率都是男性的2倍。

3、同源重组的功能

维持生物种群的多样性，且可以用于损伤修复。并且染色体瞬间的物理连接对染色体正确分离到子代细胞中至关重要

4、同源重组的机制

断裂-复合（breakage and reunion）

1）异源双链（heteroduplex）：在重组部分，每个双链中均有一段DNA链来自于另一个双链中的单链，这个部分就被称为异源双链（杂种DNA）

2）分支迁移（branch migration）：异源双链的交叉连接中，交叉点沿着两条链移动，称为分支迁移。

3）Holliday结构：两个DNA分子交叉重组时，在连接处形成一个“四螺旋”作为中间产物，这种结构就叫做Holliday结构。

5）重组体的形成

在受体DNA链上形成双链断裂；通过核酸内切酶扩大受体切口，产生3’-端单链；受体3’-端迁移至供体同源区；受体3’-端修复延伸合成；供体置换、链迁移至受体链；在受体上的另一个3’-端DNA合成；相互迁移产生双链交换。

6）细菌重组酶（RecBCD酶）

RecBCD酶的活性包括：①强的核酸酶活性可降解DNA；②解旋酶活性，在SSB存在时它可解开双链；③ATPase活性。RecBCD酶在重组中的作用是与双链断口结合，解开DNA链并导入裂口，产生带有游离3’端的单链区。目前认为DNA损伤和复制叉停滞等原因是产生双链断裂的主要来源。RecBCD酶的倾向性位点为chi。在E. coli中每隔5~10kb有一个拷贝。当RecBCD结合在DNA Chi位点的3’侧时，它沿着DNA向5’移动使DNA解旋，并降解带有3’端的单链。当到达Chi位点时停顿下来，并切开chi 3’侧的一条单链DNA，切点距Chi 3’侧4~6bp处。Chi位点的识别导致RecD亚基解离或失活，结果使复合物RecBC失去核酸酶活性，但继续发挥解旋酶作用。

5、细菌的基因转移与重组

细菌细胞间的基因转移具有多种途径，这有利于适应环境。细菌的基因转移包括：接合（conjugation）、转化（transformation）、转导（transduction）和细胞融合（cell fusion）。外源基因在受体细胞中的结局就是可能被降解或临时保留或与内源基因置换以及整合。

1）接合

当两个细菌细胞相互接触时，遗传信息可能由一个细胞转移到另一个细胞。这种能力是由接合质粒（conjugative plasmid）提供的，它可以编码与接合有关的蛋白质。

2）转化

遗传转化（genetic transformation）指的是细菌吸收外源DNA而改变遗传性状的过程。具有摄取周围环境中游离的DNA分子能力的细菌细胞称为感受态细胞（competent cell）。大肠杆菌用一定浓度Ca 2+ 处理可诱导细胞成为感受态。

3）转导

通过噬菌体将细菌的基因从供体转移到受体细胞的过程。包括普通性转导（generalized transduction）和局限性转导（specialized transduction）.

普遍性转导指的是宿主基因组任意位置的DNA成为成熟噬菌体颗粒DNA的一部分而被带入受体菌（噬菌体感染宿主并进行繁殖，同时使宿主DNA降解为小片段，噬菌体装配时可能误将细菌的DNA片段装入噬菌体的头部，成为一个转导噬菌体。转导噬菌体感染另一宿主菌将其头部的染色体注入受体菌内）。局限性转导值得是某些温和噬菌体在装配病毒颗粒时将宿主染色体整合部位的特定DNA切割下来带走，而将自身的一段DNA留在细菌染色体上，取代病毒DNA。

4）细菌细胞融合

在有些细菌的种属中可发生由细胞质膜融合导致的基因转移和重组。在实验条件下，用溶菌酶除去细菌细胞壁的肽聚糖而成为原生质体，可人工促进原生质体的融合，由此使两菌株的DNA发生广泛的重组。

位点专一性重组

概念

位点专一性重组是在专一酶的作用下，在DNA特定位点上发生的断裂和重接，从而产生精确的DNA重排方式。

特点

1）位点专一性重组不依赖于序列的同源性，而依赖于DNA上专一位点（DNA序列，通常14~50bp，序列有的相同，有的不同）引起。

2）依赖于专一酶的识别（目前发现的重组酶有100多种），在酶的催化下，DNA链断裂和重接。

3）位点专一性重组在在细胞中特定的条件下发生的，它可以参与某些蛋白质二代表达（如抗体基因），这种专一性的酶是被细胞中的调节因素所引发的。

4）重组后，原先存在的DNA顺序全部被保留下来，并无丢失（保守重组）

位点专一性重组的机制

高等生物的抗体基因重组都属于位点专一性重组

1、λ噬菌体的整合（integration）

λ噬菌体DNA编码的λ整合酶（integrase）能指导噬菌体DNA插入E.coli染色体中。λ噬菌体和宿主的DNA分子都有特异位点（小段同源序列，称为附着点att，attachment site)，噬菌体的DNA借着att与大肠杆菌的DNA靠在一起后，其整合酶即与att结合，催化整合反应，将两个环状DNA分子变成一个大环。

1）细菌DNA和λ-DNA的专一附着位点

λ 噬菌体和细菌DNA 发生重组交叉的特异位点为attP 和attB。attB和attP中有相同的核心序列。整合酶与两个核心相结合。整合酶不但要求特异的序列，且要求两个核心序列有同源性。

2）整合蛋白

整合过程需要整合酶和整合作用宿主因子（IHF ，integration host factor ）。IHF 是E.coli 染色体DNA 上himA 和himD 编码的，him 突变阻止λ 位点专一性重组的发生。

3）噬菌体的整合过程

当整合反应发生时，整合酶（integrase, int ）识别attP，整合酶（integrase, int ）和整合作用宿主因子（IHF ，integration host factor ）结合形成整合体(intasome)。整合酶（integrase, int ）蛋白交错切割（staggered cut）attP（λ ）和attB （E.coli ）， 互补链进行交叉杂交（互补单链为7b) ， 即在attP 和attB 处发生交叉重组，封闭连接端切口。

IHF是由基因himA和himD编码的2个亚基组成的蛋白。him基因突变会阻断λ位点特异性重组，也能被int突变所抑制，表明IHF和Int可相互作用。位点特异重组可通过Int和IHF在体外来完成。它涉及精确的断裂和重接而不需要任何DNA合成。attB和AttP的大小就表明它们在重组中所起的作用是不同的。AttP提供了附加的信息，以区别于attB。

4）λ噬菌体的切出过程

如果λ前噬菌体受到诱导（induction）时则整合作用将被逆转，此过程称为切离（excision）。切出后细菌和噬菌体DNA恢复至原来完整状态。整合和切离反应作用位点是不同的，因此这两个反应所依赖的蛋白也不完全相同。

整合（attB×attP）反应需要噬菌体int基因的产物和宿主的整合因子（integration host factor, IHF）。切离（attL×attR）需要噬菌体xis基因产物及Int和IHF蛋白参与。整合和切离都需要Int和IHF，但Xis控制反应方向。它是切离所需要的，抑制整合作用。

基因表达的调控

在一个DNA分子上两个特异位点之间发生重组，会得到两种结果：两个位点之间的片段丢失，或被颠倒。生物利用这种机制常常调节体表蛋白的表达。如：锥虫（trypanosomes）的表面抗原千变万化，用以逃脱宿主免疫系统的攻击，这也是通过一系列DNA重排达到的。

转座重组

转座子概述

DNA的转座是由可移位因子（Transposable element）介导的遗传物质重排现象

1、转座子概念

转座子（transposon）是存在于染色体上DNA上可以自主复制和移位的基本单位。转座子可反复插入到基因组中的许多位点，它可从基因组的一个位点转移到另一个位点；从一个复制子转移到另一个复制子。在转座过程中，转座子的一个拷贝常留在原来位置上，在新位点上出现的仅是拷贝。它依赖于DNA的复制。

2、转座子的特点

转座子是不必借助于同源序列就可以移动的DNA片段，即转座作用与供体和受体间的序列无关。原核生物和真核生物都有转座子。转座序列可以沿着染色体移动，甚至可以在不同染色体间跳跃（跳跃基因）。

3、转座子的种类和结构特征

原核生物中发现有简单转座子和复合式转座子

1）简单转座子

简单转座子（插入序列，insertion sequence，IS）不含有任何宿主基因，简单转座子是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。转座子常常被定位到特定的基因中，造成该基因突变，IS中则仅含有编码其转位所需的转座酶（transposase）的基因。

简单转座子两端具有20~40bp的反向重复序列（inverted repetitive sequence, IR)或正向重复序列（direct repeats, DR）。简单转座子具有1kb左右的编码区，它仅编码和转座有关的转座酶（transposase）。简单转座子对靶的选择有：随机选择、热点选择和特异位点的选择。

2）复合转座子

复合转座子（composite transposon）是一类除了含有转座酶基因外，还带有其它基因（如某些抗药性基因或其他宿主基因）的转座子。复合式转座子两翼往往是两个相同或高度同源的简单转座子序列。复合式转座子两翼序列表明简单转座子序列插入到某个功能基因两端时就可能产生复合转座子。一旦形成复合转座子，简单转座子序列就不能再单独移动，因为它们的功能被修饰了，只能作为复合体移动。

转座作用的机制

转座酶（transposase）与转座子两端以及将要插入的DNA靶序列相结合，然后转位酶在靶上交错切割，同时在转座子的两条不同的链两端各进行单链切断。产生的转座子游离端和靶序列的游离端相连接，成一个DNA分子。转座时，受体DNA的靶序列 （3~12bp）被复制，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。转座子的转座作用可以分为简单转位作用与复制型转位作用两种。

1、简单转座作用

简单转座只是将转座子转移到新的位点上。转座子会整体转移到新的受体DNA上，而在原来宿主DNA上留下一个空隙。转座酶在靶序列上交错切割，同时在转座子的两条不同的链两端各进行单链切断。产生的转座子游离端与靶序列的游离端相连成一个DNA分子。

2、复制性转座（replicative transposition）

转座子作为可以移动的元件被拷贝，一个拷贝留在供体原来的部位，另一个拷贝插入受体的靶位点，结果供体和受体都有一个转座子拷贝。

转座的遗传学效应和意义

1、转座的遗传学效应

转座可能引起插入突变，并且造成插入位点靶DNA的少量碱基对重复。除此之外，转座还会导致产生新的基因或者是产生染色体畸变。并且转座的发生也会对原位置产生一定的切除效应（准确切除：使原插入发生恢复突变；不准确切除：留下转座子残迹，产生插入突变，但转座子标志消失）

2、转座子效应的意义

可以使原来距离较远的基因组合在一起形成一个操纵子；可以将原来两段分离的DNA序列连接在一起组成一个新蛋白的基因；位于启动子部位的插入，可以控制基因的 打开或关闭。转座基因插入时，大多数受体基因被钝化；但也有被活化的基因；转座子有自己的启动子，在转录转座酶时，其它相邻基因可被转录。当然为了避免转座频率过高对细胞产生影响，因此细胞中也存在着平衡转座过程的途径。

3、转座频率的控制

转座频率的调控对细胞非常重要，一个转座子为了存活必须要维持一定的最低运动频率；如果频率过高可能对宿主细胞有害

1）IN/OUT RNA配对抑制转座酶合成

OUT RNA作为一个反义RNA行使功能。OUT RNA在单拷贝情况下没有作用，但当拷贝数＞5时有显著作用。通常每个IS10拷贝对应～5拷贝的RNA（在典型的多拷贝情况下对应～150个OUT RNA拷贝），OUT RNA与IN RNA配对；多余的OUT RNA确保在核糖体能够结合IN RNA之前与之快速结合，所以配对的IN RNA不能被翻译成转座酶

2）甲基化作用对转座的抑制

Dam甲基化作用为单个元件提供了最重要的调控系统。它降低了转座频率，特别是降低双转座(Couple transposition)通过复制叉的频率。

3）终止子和mRNA二级结构对转座酶表达的调控

转座子是随机选择其靶位点的，因此它很可能与一个有活性的操纵子结合，从外部转录转座酶基因

4）转座酶的偏好性

转座酶的水平限制了转座的速度。转座酶很偏爱顺式作用；即只有转录并翻译这种酶的DNA模板链存在时，它才会有效地发挥作用。顺式倾向性是由插入序列元件编码的转座酶的普遍特征。

对转座频率的限制：控制转座酶的合成或功能；DNA复制后的甲基化控制；转座酶对顺式序列的偏好；

RNA的IN/OUT配对抑制转座酶合成

真核生物中的转座子

转座子不仅存在于原核生物中，还存在于真核生物中

反转录转座子

1、逆转录病毒

逆转录病毒（retroviruses）的基因组是单链的RNA，它被逆转录成双链DNA中间体复制，双链DNA通过类似转座的机制被插入到宿主基因组中。它们的转座是通过RNA介导的。因此称之为反转录子（retroposons）或反转录转座子（retrotransposons）。被整合到细胞基因组中的逆转录病毒序列称为原病毒(Provirus)。整合原病毒的形式是线形DNA，DNA两端序列都是“U3-R-U5”，称为LTR（long terminal repeat，长的末端重复序列）。

2、酵母的Ty元件

Ty（transponson yeast，酵母转座子）是由分散的DNA重复序列家族组成，在不同品系的酵母中它们所处的位点不同。在不同Ty元件之间有很大的不同。大部分元件属于两个大家族。被称为Ty1和Ty917。Ty元件可被转录成2种带有poly(A) + 的RNA，Ty序列有两个同向的开放阅读框，这两个阅读框有13个氨基酸的重叠。TyA序列编码一个DNA结合蛋白质。TyB含有与逆转录病毒的逆转录酶、蛋白酶和整合酶基因同源的序列。Ty元件是典型的转座子，需要通过RNA中间体进行转座。

1）Ty元件与反转录病毒的相似之处

原来的Ty元件两端的δ序列是不同的，但转座后的Ty两端具有相同的δ序列，如同LTR；转座是由Ty元件内的基因控制的；虽然Ty元件不产生感染颗粒，但在经诱导发生转座的细胞中存在着Ty病毒样颗粒（VLP），它们含有全长的RNA、双链DNA、TyB产物、TyA的产物像gag的前体一样被剪切产生VLP成熟核心蛋白质；仅有某些Ty元件在任何酵母基因组中都有活性；大部分没有转座能力，这和惰性的内源性前病毒相似

3、果蝇中的反转录子

包括copia反转录子，末知类型的FB家族和已介绍的P元件

1）Copia

copia是反座子研究最多的一个家族。它的名子反映了存在大量密切相关的编码高丰度mRNAs的序列。copia的拷贝数是由果蝇的品系决定的。每个copia两端的正向重复序列都是相同的，表明在相关的过程中它们可能相互作用，或者二者都是在转座中由一祖先元件的一个正向重复序列产生的。

2）FB元件

黑腹果蝇中另一个转座因子家族的成员是FB（foldback，折回），它具有长度不同的反向末端重复序列。

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