Deep multiomics profiling of brain tumors identifies signaling networks downstream of cancer driver genes

脑肿瘤的深度多组学分析鉴定了癌症驱动基因下游的信号网络

期刊：Nat Commun；影响因子：12.121

发表单位：圣裘德儿童研究医院等

导 读

    癌症生物学的一个侧重点是研究癌基因如何驱动分子信号网络的重组来执行表型改变。由于信号转导网络受蛋白质翻译后修饰（尤其是磷酸化）的高度调控，因此磷酸化蛋白质组学分析对于研究癌症信号转导必不可少。以质谱（MS）为基础的蛋白质组学技术已经逐渐成为全基因组蛋白质组和磷酸化的无偏分析主流策略，结合先进的DNA测序，这些方法为深度组学分析提供了前所未有的机会。整合转录组、蛋白质组深和磷酸化来剖析致癌信号网络，能够扩大对癌症生物学的理解。

    高度神经胶质瘤（HGG）是最普遍的恶性脑肿瘤。虽然高通量测序已展示了全基因组突变景观，但对基因表达途径失调的了解仍不清楚，缺乏深层的HGG蛋白质组学图谱。2019年8月发表在《Nature Communications》的一项研究中，以HGG小鼠模型为研究对象，采用高深度蛋白质组学、磷酸化修饰组学和转录组学的多组学整合研究，比较了两种由致癌受体酪氨酸激酶（PDGFRA D842V突变和TPM3-NTRK1融合）驱动的HGG小鼠模型，检查这些癌症驱动基因下游的信号网络，并结合CRISPR-Cas9验证筛选提供了新的肿瘤潜在治疗思路。

摘 要

    高通量组学方法为剖析癌症生物学中的分子机制提供了更大的机会。本篇研究对由突变RTK致癌基因PDGFRA和NTRK1驱动的两个高级神经胶质瘤（HGG）小鼠模型的完整蛋白质组、磷酸化蛋白质组和转录组进行深入分析，通过质谱分析了13860个蛋白质和30431个磷酸位。系统生物学方法可识别众多主调节因子，包括41种激酶和23种转录因子。信号通路活性的计算和小鼠的存活率表明，NTRK1突变诱导更高的AKT下游靶点激活，包括MYC和JUN，驱动正反馈回路上调多种其他RTK，并比PDGFRA突变具有更高的致癌效力。CRISPR-Cas9验证筛选显示56％的受测主调节剂对NTRK驱动的HGG细胞（包括TF（Myc和Jun）和代谢激酶（AMPKa1和AMPKa2）的生存力至关重要，证实了多组学整合方法的有效性，并提供了新的肿瘤脆弱性。

研究概要

1    小鼠HGG的深度蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析

    作者通过在小鼠颅内植入PDGFRA D842V突变或TPM3-NTRK1融合（人类HGG中发现的两种致癌RTK）转导的原代星形胶质细胞，构建了两种HGG小鼠模型，分别称为NTRK HGG和PDGFRA HGG小鼠。组织观察显示，HGG以局灶性肿块的形式生长，在肿瘤的边界处有明显的浸润区域进入周围的实质。对HGG和正常小鼠皮质样品进行蛋白质组、磷酸化蛋白质组和转录组分析，共定量了13860个蛋白质（11941个基因产物，200454个肽）和30431个磷酸位点（5959个磷蛋白，45574个磷肽）。

    主成分分析（PCA）和层次聚类分析表明，两种RTK致癌基因可驱动不同的蛋白质组、磷酸化蛋白质组和转录组图谱，表明两种致癌RTK可以驱动HGG，其具有可重现的不同全局蛋白质组和磷酸化蛋白质组谱。转录本水平和蛋白质丰度显示中等程度的相关性，与先前报道的数据集相一致。作者还通过与蛋白和磷酸数据库的比较，表明了蛋白质定量和修饰的具有很大的覆盖深度。

图1，HGG小鼠模型的深度定量组学分析。a，HGG小鼠模型分析的概述；b，小鼠神经胶质瘤的组织染色；c，蛋白质组学工作流程；d，验证癌症驱动基因的表达。 图2，多组学数据分类。a、b，蛋白质组和磷酸化蛋白质组的PCA（a）和无监督的层次聚类（b）；c、d，转录组的PCA（c）和无监督的层次聚类（d）；e，转录组和蛋白质组丰度之间的相关性。

2    蛋白质组学分析揭示了HGG网络模块和途径

    在小鼠HGG中鉴定了差异表达的蛋白质，然后进行基因共表达聚类和功能模块分析，共鉴定了4703个差异蛋白和6768个差异磷酸化位（2301个磷蛋白），被分配到5个蛋白模块（WP-C）和5个磷酸蛋白模块（PP-C）中。总的来说，HGG肿瘤主要包括癌症信号传导、基因表达、细胞粘附、代谢和神经元功能在内的一系列模块组。三个簇（WP-C1、PP-C1和PP-C2）显示出相似的变化模式：皮质<PDGFRA HGG<NTRK HGG，大多数已知的神经胶质瘤途径都在这三个簇中富集，表明NTRK HGG激活了类似的致癌途径，但在整体途径水平上的反应程度比PDGFRA HGG高。大多数HGG癌症信号传导途径仅在磷酸化蛋白质组中发生变化，而在整个蛋白质组中未发生变化，突显了磷酸化蛋白质组图谱对解码致癌信号的必不可少的作用。转录因子、表观遗传基因、激酶和癌症基因在重编程信号网络和维持肿瘤动态平衡方面起着积极作用。与PDGFRA相比，NTRK基因型驱动了更强的全局重编程基因型。

图3，全局网络分析可以识别HGG中的网络模块。a，分析概述；b、c，通过WGCNA分析检测到多个具有不同模式的差异完整蛋白（WP）和磷蛋白（PP）共表达簇；d、e，关键的网络模块，并进行了功能聚类；f，共表达簇中富集的途径的总结。

3    多组学集成可识别主激酶和转录因子

    基于底物磷酸化水平推断蛋白激酶的活性，并通过层次聚类分析将激酶活性分簇，显示了三种主要差异调节模式。构建激酶-底物信号网络，多个已知激酶在HGG被识别，涵盖AKT、PKC、MAP激酶级联和SRC家族激酶。调节关键细胞内系统的激酶在网络中富集，包括AMPK（PRKAA1、PRKAA2）和p21激活的激酶（PAK1、PAK3）。与正常皮质相比，HGG还显示出更高水平的CDK5、CAMK2A和CAMK2D。这些激酶是神经元功能和突触可塑性的良好表征的调节剂，它们在成胶质细胞瘤中促进迁移和侵袭，并在线粒体和钙信号调控中发挥作用。NTRK HGG在AGC和CMGC超家族中显示的活性比PDGFRA HGG更高，表明更强的细胞增殖信号和细胞周期。AKT是RTK激活后PI3K-AKT信号级联的中心节点，34个AKT底物显示出与AKT活性一致的磷酸化模式，活性最高的AKT底物是细胞周期和增殖调节剂、中央葡萄糖代谢调节剂以及迁移和血管生成调节剂。总之，全面的激酶活性分析能够在两个HGG肿瘤模型中鉴定主激酶和激酶激活的下游结果，PI3K途径激活由HGG中不同受体酪氨酸激酶突变驱动。

图4，激酶活性分析揭示了HGG中的活性激酶、激酶超家族和AKT底物。a，激酶活性的分层聚类分析；b，核心激酶转激酶信号网络；c，将单个激酶活性归纳到激酶超家族中，表明AGC和CMGC超家族富集；d，AKT激活的假定底物，是HGG中PI3K-AKT级联的中心枢纽。

    作者还通过对小鼠HGG中的转录组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组进行了综合分析，探索了转录因子（TF）的活性。转录组中的靶基因表达共有47种TF活性，蛋白质组和磷酸化蛋白质组数据支持了23个TF的激活。激活程度最高的TF包括TFII家族（GTF2B、GTF2F1、TAF、TAF7和TBP），它们组装RNA聚合酶II预起始复合物并控制总体转录速率。转录抑制因子REST靶基因的表达在肿瘤中较低，在正常皮质中较高，暗示通过抑制靶基因表达，REST在HGG肿瘤转化中可能发挥作用。这种综合分析揭示了TF激活导致肿瘤细胞转录组和蛋白质组的重编程。

    考虑激酶、TF与靶基因的关系，作者表征了它们在HGG中一致的共激活模式。以激酶-TF为中心的简化网络由五个激酶（AKT1、MAPK3、CDK5、PRKCA和AMPK）和六个TF（c-MYC、JUND、JUN、EP300、BRCA1和CEBPB）组成。最活跃的生物学过程与增殖相关，包括核糖体的生物发生、翻译和RNA加工（c-MYC，BRCA1和CEBPB的靶标）、线粒体和能量代谢（c-MYC，JUN和EP300的靶标）以及细胞迁移、细胞外基质和粘着斑（JUN和EP300的靶标）。c-MYC、JUN和EP300通过主能量和增殖传感器激酶（AMPK和MAPK）的磷酸化被激活，这三个TF激活的多种代谢酶在增殖和能量压力期间至关重要。总之，系统生物学方法显示了在处理中心TF、激酶及其在HGG肿瘤中相互作用的优越性。

图5，多组学集成可识别活性TF，并在HGG中构建核心激酶-TF网络。a，通过转录组、蛋白质组、磷酸蛋白组构建激酶-TF网络的过程；b，HGG中的激活的TF；c，整合分析揭示了一个推定的核心信号网络，包括选定的激酶、TF和具有共激活模式的基因靶标。

4    在小鼠HGG中，NTRK是比PDGFRA更强的致癌驱动程序

    NTRK HGG的网络规模比PDGFRA HGG更强，表明NTRK的致癌效力高于PDGFRA突变。为了评估RTK癌症驱动基因的致癌潜能，作者计算了PI3K-AKT信号总和。在两种HGG中，PI3K-AKT途径明显激活，并调控了相似的下游途径，例如蛋白质合成（S6、4EBP1和EIF4B）、细胞周期进程（RB1，MYC和RB12）、细胞增殖和血管生成（BRCA1、eNOS、ERK）。比较这些蛋白在NTRK和PDGFRA HGG之间的差异磷酸位点时，NTRK HGG的磷酸位改变程度高于PDGFRA HGG，并表现出更高的PI3K-AKT信号传导活性，表明TPM3-NTRK1融合基因具有比PDGFRA D842V更强的致癌能力。类似地，NTRK HGG小鼠的生存时间比PDGFRA HGG小鼠更短。

图6，在小鼠HGG中，NTRK融合比PDGFRA突变是更强的致癌驱动因子。a，PDGFRA驱动和NTRK驱动的HGG小鼠中，PI3K-AKT途径激活；b，NTRK HGG显示出比PDGFRA HGG更强的PI3K-AKT信号传导活性；c，与PDGRA HGG相比，NTRK HGG显示出更高的细胞增殖指数；d，NTRK驱动的HGG比PDGFRA驱动的HGG表现出较短的肿瘤发作潜伏期。

5    CRISPR-Cas9筛选可验证HGG中的分子靶标

    最后，作者结合上述多维组学的数据，通过CRISPR-Cas9的方法对发现的一些关键作用基因如转录因子或关键激酶等分别进行敲除筛选，以期寻找潜在的肿瘤治疗靶点，为后续转化医学研究提供新思路。其中调节细胞代谢的所有三种激酶（PRKAA1、PRKAA2和EEF2K）都有助于HGG细胞的活力，提供了一种新型的肿瘤易感性。在筛选过程中，两个TF（Jun和Myc）被证明是阳性，鉴于RTK-PI3K-AKT诱导了广泛的下游变化，Jun和Myc可能对RTK融合如何诱导HGG肿瘤发生产生有价值的见解。总之，CRISPR-Cas9筛选揭示了能量代谢的新型肿瘤脆弱性，并且Jun和Myc参与了NTRK融合诱导的肿瘤发生，共同证实了多组学整合方法发现主调节剂的有效性。

图8，CRISPR-Cas9验证筛选可识别HGG中的新型候选分子。a，CRISPR-Cas9功能筛选的工作流程；b，靶向顶级调控因子的CRISPR-Cas9功能筛选可鉴定HGG生存力的基因，从而证实了多组学整合分析的有效性。

讨 论

    转录组学和蛋白质组学分析对于理解癌症生物学中潜在的中央调节机制都起着不可或缺的作用。本篇多维组学大数据文章充分展示了利用强有力的系统生物学分析手段并结合高质量的深度覆盖蛋白质组学、修饰组学以及转录组学数据能够全景式呈现蛋白调控网络变化的全貌，进而发现新的调控通路或调控模式，展示了整合多组学数据集以探测潜在致瘤性分子机制的强大功能。此外，结合CRISPR-Cas9功能筛选进一步验证了多组学整合方法的强度，并鉴定了多个肿瘤脆弱性以设计靶向癌症治疗方法，使研究更具实际意义。