本次精读的文献是今年发表1月26日在线发表在《Autophagy》上的一篇文章，通讯作者是武汉大学的孙蒙祥教授，他一直致力于被子植物生殖发育生物学和生殖细胞工程的研究。该研究证明了自噬途径参与了烟草花粉正常萌发的过程。
在先前鉴定烟草有关自噬基因的过程中，作者发现在花粉萌发的过程中与自噬相关的ATGs的表达量大大增加且在成熟的花粉当中达到最大，暗示着自噬的过程可能参与了植物正常的生长发育。于是作者就想以烟草为模型探究是不是这样。
幸运的是，作者通过多种手段，发现在花粉的萌发过程中，自噬的活性就大大增强。利用透射电子显微镜在萌发后30min观察，便发现自噬小体的存在，当用Con A（伴刀豆球蛋白A，能使得液泡酸化，并防止自噬小体降解）处理，发现自噬小体在靠近萌发孔的液泡中富集。在光学显微镜下，利用标记自噬小体的ATG8特异性抗体进行免疫检测显示，自噬小体在萌发孔处有明显的点状聚集。RT-qPCR也显示在萌发一小时后，大多数自噬相关的基因表达上调，随后下调，暗示自噬参与了花粉萌发的过程。
Assessment of autophagic flux in germination aperture
Immuno-fluorescenceof germination aperture using the ATG8 (red) antibody
Expressionpattern of ATGs during the process ofpollen germination
为了证明自噬确实参与了花粉萌发的过程，那就干掉他。于是他们就用了自噬的抑制剂3-MA，是磷脂酰肌醇3-激酶（PtdIns3K）抑制剂体外处理花粉萌发。发现用抑制剂处理过后的花粉的确不大萌发。而且抑制剂处理萌发具有剂量效应（定性实验）。随后利用ATG8的抗体去标记自噬小体，发现加入3-MA后，自噬小体的形成的确变少（约70%）（定量实验）。至此，可以的确说，自噬的确参与了花粉萌发的过程。
Autophagyinhibitor 3-MA inhibit pollen germination
Frequencies of pollen germination
3-MA inhibit autophagosomeformation in germination aperture
为了进一步探究自噬在花粉萌发过程起的作用，作者将正常的花粉萌发的状态与用3-MA的处理的花粉萌发做对比。发现3-MA处理过程，萌发孔附进会形成凸起的细胞质结构，并且与其他细胞质显著不同。作者认为自噬的活性主要是为了去除这个凸起的细胞质结构。
a convex layer of cytoplasm
在先前的研究中已经知道自噬的活性是与ATG这个家族的基因有关，于是作者开始探究机制。于是作者筛选了三个单拷贝ATG2,ATG5以及ATG7这三个基因进行探究（不是PtdIns3K复合体），并分别构建RNAi的载体。发现ATG2，ATG5以及ATG7（在附件里）的表达下调的确造成了花粉萌发率的下降，这与3-MA处理的表型很类似。并且ATGs的下调并不会导致花粉活力的下降但是只有约30%-50%的花粉能萌发。
Expression level of ATG2 or ATG5
The frequencies of pollen germination
The frequencies of pollen germination
Silencingof ATGs did not destroy pollenviability
下面的工作重心无疑是探究花粉萌发的失败与ATGs导致的自噬关系到底是怎么样的？作利用自噬水平评估的ATG8和ATG13作为报告子进行Western blot，可以看出ATG8和ATG13在RNAi的植物中表达量下调，暗示着当其中一个基因表达下调时，自噬水平将会被下调。利用免疫荧光检测，发现在RNAi的植株中，自噬小体的数目明显减少，为了区别自噬小体的减少到底时形成减少还是快速降解，利用Con A也不能使得自噬小体的数目恢复到野生型的水平，说明ATGs参与的是自噬小体的形成，利用crispr突变体atg5。进一步说明了的确是自噬小体形成出了问题。
ATG protein levels
Immuno-fluorescence ofgermination aperture of pollen
Immuno-fluorescence ofgermination aperture of pollen of atg5 mutant
为了进一步探究自噬小体的形成与ATGs的关系，作者利用ATG8的脂化程度进行分析，因为这对于自噬小体的形成是必不可少的。从WT和ATGs-RNAi的花粉中收集了所有的膜组分，然后在PLD（磷脂酶D）预处理之前或之后通过免疫印迹分析测定了ATG8的脂化作用。 在SDS-PAGE后，通常在免疫印迹中检测到ATG8–PE的迁移带比ATG8更快。可以看到野生型经过处理后跑的更快，证实它们是脂化的ATG8。可是在ATGs-RNAi的植物中，ATG脂化程度下降至一般一下。并且在ATGs-RNAi的植物中，也发现萌发孔处有凸起的细胞质层,并且对其面积进行了定量化。
immunoblot
Relative ATG8–PE levels
a convex cytoplasm layer in RNAi line
为了探索花粉萌发初期自噬与脂质之间的关系，通过液相色谱-质谱法（LC-MS）对野生型和ATG RNAi植物的花粉进行脂质组分析。在野生型和ATG沉默的花粉中鉴定并定量了几类鞘脂，磷脂和甘油脂。潜在结构的正交投影-鉴别分析（OPLS-DA）显示了WT和ATG_RNAi系之间的明显分离，表明各个ATG RNAi系的脂质组成存在明显差异。随后对于参与自噬的脂类进行详细分析，三种磷脂： phosphatidylinositol (PI), phatidylethanolamine(PE) 和phosphatidyl-choline参与自噬小体的形成，其中PI能在自噬小体成核过程中被VPS34磷酸化形成PtdIns3K，其表达水平在RNAi的植株中大大降低。此外在ATGs_RNAi的花粉中，分别为囊泡成核和吞噬细胞扩张所必需的PE和磷脂酰胆碱的表达水平也降低了，同时伴随着一些溶血PEs（LysoPE）和溶血磷脂酰胆（lysophosphatidylcholine）的表达水平升高。
此外在哺乳动物中，鞘脂的外源性神经酰胺（Cer）能够通过抑制氨基酸摄取并诱导BECN1 / Beclin1的表达来激活自噬，即酵母VPS30 / ATG6的哺乳动物直系同源物。 有趣的是，ATGs_RNAi的花粉中的Cer水平显着高于野生型。从内部线粒体重新分布到外部线粒体表面的磷脂心磷脂（CL）对于受损线粒体的自噬是至关重要的。 相对于野生型，RNAi植物中的花粉中CL积累至较高水平。磷脂酰甘油（CL合成的重要底物）也积累在ATGs_RNAi的花粉中。 同理，与WT相比，在ATGs_RNAi的花粉中溶血磷脂酰甘油（用于合成磷脂酰甘油的前体）的水平也增加了。三酰基甘油（TAG）是许多植物花粉粒中脂质体内存储的主要成分。 抑制自噬可能导致植物和哺乳动物体内脂质的增加。所以，作者重点研究了TAG和二酰基甘油（DAG，TAG合成中的中间代谢物）的组成。 在ATGs_RNAi中均观察到TAG和DAG的大量积累。 有趣的是，一种的两亲脂质亚类，ω-羟基脂肪酸，在自噬缺陷型花粉中也积累了较高的水平。以上研究说明自噬导致的膜组分的变化保证花粉的正常萌发。
OPLS-DA of lipid levels
Levels of phosphatidylinositol (PI) decreased
Heat map shows the relative PE and LysoPE (LPE) levels
Inhibition of autophagy leads tothe increase of Cer
Inhibition of autophagy leads tothe increase of CL and TAG
最后作者利用串联质谱标记（TMT）进行定量质谱分析，探寻ATG2和ATG5下游蛋白表达的变化。其中4.3% 和2.8%在ATG2- 和 ATG5-silenced pollen中上调， 2.6% 和2.8% 下调。所以作者认为自噬途径对于花粉的蛋白组来说具有重要作用。且ATG2_RNAi和ATG5_RNAi中up和down存在较多的overlap可能调控了共同的途径。但是GO分析显示，ATG2主要富集含核糖体蛋白和核糖核蛋白相关组分，而ATG5富集含肽酶和蛋白酶体相关组分，表明其功能的差异性。在细胞组分方面，我们可以发现线粒体质子运输ATP合酶复合物相关的蛋白下调明显，细胞膜组分上调明显。生物学过程中，下调的蛋白富集于细胞氮化合物的生物合成过程和ATP合成与质子运输耦合，而上调的蛋白富集于小GTPase介导的信号转导。因此作者认为，ATG2和ATG5主要通过线粒体ATP与蛋白质合成途径来影响花粉萌发。为了证实这一结果，作者还鉴定富集的途径，发现上调和下调的蛋白质都被归类为与氧化磷酸化有关的途径。
Venn diagrams
Volcano plot
Go analyse D cc E bp F Enriched pathways
这篇文章揭示了自噬是如何参与花粉萌发的过程，并且揭示其对于脂质组分的影响以及下游蛋白的影响。但是这些ATG蛋白似乎能在花粉萌发过程中起作用，似乎冗余，但是每个RNAi的植株都有表型，这让我感觉到很奇怪，如果能做个双突变或者三突是不是更好。此外，其余在花粉萌发过程中的表达有变化的ATG其功能是什么？还有待进一步挖掘。
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