文章信息
文章题目：Longitudinal single cell transcriptional and epigenetic mapping of effector, memory, and exhausted CD8 T cells reveals shared biological circuits across distinct cell fates
期刊：bioRxiv
链接：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.03.27.485974v1
摘要
初始CD8 T细胞经受抗原刺激后可以增殖分化为效应（Teff）、记忆（Tmem）或耗竭（Tex）CD8 T细胞。这些不同的分化发育途径通常伴随着各自特异的转录组和表观遗传特征的改变，从而赋予不同CD8 T细胞亚群特异的功能特性和免疫治疗潜能。目前，人们对CD8 T细胞的不同分化发育轨迹的潜在分子机制和Teff、Tmem和Tex细胞亚群的异质性特征仍知之甚少。在本文中，我们基于淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）的急性和慢性感染模型，使用单细胞scRNA-seq和scATAC-seq数据的整合分析来解决这些问题。我们的分析结果揭示了新的T细胞亚群子集，包括一个耗竭Tex细胞子群Exh-KLR，它高表达NK细胞相关基因，以及在急性和慢性感染中鉴定到多个不同的TCF1+ 干/祖细胞样细胞亚群。这些数据还揭示了PD1 通路阻断对Tex细胞子集重塑的见解，并确定了细胞应激调节因子 Btg1 在 Tex 细胞分化中的关键作用。最后，我们的结果还强调了具有不同染色质景观的CD8 T细胞在不同分化发育途径中可以使用共享的生物学特征，如细胞毒性或干细胞/祖细胞性。因此，本研究的单细胞转录组和染色质可及性图谱阐明了CD8 T细胞发育生物学和调控 Teff、Tmem 和 Tex 细胞亚群分化的潜在分子机制。
研究结果
PD1通路阻断促进耗竭CD8 T细胞亚群的分化
最近的几项研究表明，Tex细胞亚群在经历PD1检查点阻断或抗原清除后，由于其独特的表观染色质特征限制了它们去分化的潜能。PD1检查点阻断可以靶向耗竭祖细胞Exh-Prog，从而增加中间过渡态Tex细胞。我们的数据表明，中间过渡态Tex细胞存在较大的异质性，包括了Exh-Int和Exh-KLR细胞群。但是，PD1阻断是如何影响这些异质性细胞亚群之间的平衡仍然是未知的。因此，我们接下来想探究PD1阻断是如何影响Tex细胞群的分化和动态变化的。我们对慢性感染Cl13的小鼠接种aPDL1抗体持续两周，然后使用单细胞scATAC-seq测序检测Tex细胞的响应和变化。
首先，我们想知道aPDL1抗体处理后的小鼠T细胞是如何分布在我们之前急性和慢性感染小鼠的T细胞谱图中。结果发现，aPDL1抗体处理后的小鼠T细胞大部分重叠在Tex细胞亚群中。PD1阻断后的T细胞几乎没有和急性感染中的Teff或Tmem细胞重叠，也没有产生具有特殊表观染色质特征的新的Tex细胞亚群。接下来，我们评估了aPDL1抗体处理后不同Tex细胞亚群的占比频率的变化，结果发现PD1阻断后Exh-Int细胞群发生了显著的增加，而Exh-KLR和Exh-Prog细胞群则发生了一定的减少。然而，这些变化在不同Tex细胞群间的DACRs区域只发生了较小的变化。这些结果表明，aPDL1抗体处理后Tex细胞的分化发育轨迹发生了一定的变化，伴随着Exh-Int细胞群的增加和Exh-Prog和Exh-KLR细胞群的减少。
为了进一步探究这个问题，我们将慢性感染Cl13的d30天样本经过aPDL1抗体处理和无处理对照组细胞的scATAC-seq数据进行拟时序分析，结果推断出了Exh-Prog细胞经过Exh-Int细胞后可以向Exh-Term或Exh-KLR细胞分化的轨迹。这些结果表明经过aPDL1抗体处理后Tex细胞经历了一种Exh-Prog向Exh-Int细胞分化增加的发育途径，而向Exh-KLR和Exh-Term细胞的分化减少。因此，PD1阻断的主要作用是加速了Exh-Prog细胞向Exh-Int细胞的分化途径。这些结果也表明aPDL1抗体处理后打破了Exh-KLR和Exh-Int细胞群之间的平衡，使得Exh-Int细胞群的占比增多。总之，我们的结果阐明了PD1阻断改变了已有的Tex细胞亚群之间的动态平衡，这对PD1阻断疗法的临床应用和治疗潜能提供了一定的指导。
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Figure 5. PD1 pathway blockade alters TEX subset dynamics within the pre-existing population structure
TCF1+前体细胞启动不同的发育途径向Tmem和Tex细胞分化
目前，一个未解决的问题是急性感染中产生的CD8 T细胞与Tex细胞之间是否存在一定的相似性。对于这个问题，我们主要聚焦到TCF1（Tcf7）表达的CD8 T细胞中，因为它们具有前体细胞或干细胞性特征。因此，我们将急性和慢性感染中表达Tcf7基因的细胞cluster进行比较分析。首先，我们将scRNA-seq数据中的细胞cluster进行聚类构建进化树，结果发现在急性和慢性感染中d8样本里一些转录谱相似的细胞cluster聚类在一起，而在d15样本里同一感染类型的细胞cluster聚在一起。例如，在d8样本中，急性感染中表达Tcf7基因的MP细胞与慢性感染中Exh-Pre细胞群聚在一起，表明它们具有相似的转录谱特征。然而，在d15样本里，急性感染的细胞cluster聚成一个分支，慢性感染的Exh-Prog和Exh-Pre和MP细胞聚成另一个分支。UMAP降维可视化也可以看到MP，Exh-Pre和Exh-Prog细胞聚类在邻近的区域，与Mem和Naïve细胞相隔开。基因差异表达分析发现不同细胞cluster之间存在相似和特异的转录特征。尽管在scRNA-seq表达数据中MP，Exh-Pre和Exh-Prog细胞群在进化树中聚类到同一个分支里，但是scATAC-seq数据的细胞群聚类树显示Exh-Pre和Exh-Prog细胞群存在自己独特的表观遗传特征，他们单独聚类到一个分支中。同时，相比于scRNA-seq数据，在scATAC-seq数据中MP和Mem细胞之间的表观相似性最高。这些Tcf7表达的细胞cluster在scATAC-seq数据也能清晰的区分开，其中Exh-Pre和Exh-Prog细胞群聚类在一起，远离MP和Mem细胞。这4群Tcf7+的细胞cluster之间也展现出不同的染色质可及性特征，体现了耗竭和记忆T细胞之间各自特异的ACR开放性模式。总之，这些数据阐明了病毒特异性的CD8 T细胞在Tex和Tmem细胞亚群之间存在较大的表观遗传差异。
上述结果表明MP，Exh-Pre和Exh-Prog细胞亚群之间存在相似的转录谱特征，这可能反应了T细胞激活后会表达一些共有的基因。接下来，我们将这几群Tcf7+细胞cluster进行基因差异表达分析。结果发现MP和Exh-Pre细胞之间共享了968个基因，其中有378个基因在Exh-Prog细胞中也表达。在这3群细胞中，Exh-Pre细胞具有最多的特异性表达基因（807个）。差异基因GO生物学通路富集分析结果表明，MP和Exh-Pre细胞之间共享了很多个细胞代谢相关的生物学过程，如cellular respiration, generation of metabolites 和mitochondrial function等，这表明尽管Tcf7+细胞具有干细胞样特征，但它们在急性和慢性感染的早期都是处于一种高度激活的状态。然而，在Exh-Pre和Exh-Prog细胞中病毒响应基因的表达程序与MP细胞是不同的，并且驱动T细胞耗竭的Tox基因，以及抑制性受体基因Lag3和许多干扰素响应基因ISGs（如Ifi27l2a，Isg15，Ifit3和Irf7等）在MP和Exh-Pre细胞中表达水平也是不同的。因此，急性感染中的MP细胞和慢性感染的Exh-Pre细胞之间在T细胞激活和代谢活性上共享一些转录特征。尽管如此，Tex-Pre细胞也有着自己独特的转录特征，如高表达耗竭特异的TF和抑制性受体基因。
鉴于急性和慢性感染中不同T细胞亚群之间存在表观遗传上的差异，我们接下来想比较急性感染中的Naïve和MP细胞与慢性感染的Exh-Pre细胞之间的染色质可及性差异。在所有染色质可及性增强的DACRs区域中，有三分之一的DACRs是他们之间共享的，另外各三分之一的DACRs区域是MP和Exh-Pre细胞特有的。相反，大多数可及性降低的DACRs区域是Exh-Pre细胞特有的，MP细胞只有587个DACRs区域是关闭的，而2979个DACRs区域在MP和Exh-Pre细胞中都是关闭的。在Naïve和Exh-Pre细胞中，有一些染色质可及性降低的区域邻近自我更新相关的基因，如Satb1和Lef1等。在Satb1基因处，有10个ACRs区域的染色质可及性在MP和Exh-pre细胞中丢失，而其他额外的12个ACRs区域只在Exh-Pre细胞中关闭，并且这种趋势和该基因的表达水平相一致。同样的，Lef1基因处也具有相似的染色质可及性变化模式。因此，慢性感染中的Tex前体细胞的一个重要特征就是细胞干性相关基因的表达水平下调。最后，我们还比较了Exh-Pre和MP细胞之间的ACRs区域，结果发现AP1 motif在Exh-Pre细胞特异的ACRs区域中显著富集，表明TCR信号在塑造Exh-Pre细胞的表观染色质景观中扮演着重要角色。相反，在MP细胞的ACRs区域中则主要富集着ETS家族转录因子，包括Fli1 motif。总之，这些数据揭示了在急性和慢性感染早期Tcf7表达的细胞启动了不同的分化发育途径，并且鉴定到了TCF1+干细胞样或前体细胞之间差异的生物学特征。
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Figure 6. Acute and chronic infections generate Tcf7-expressing progenitors with divergent accessible chromatin profiles
Tex前体细胞向Tex祖细胞分化过度的潜在生物学回路
最后，我们想探究耗竭前体细胞Exh-Pre向耗竭祖细胞Exh-Prog转变过程中转录组和表观组的动态变化特征，因为这个转变过程是不可逆的，会促进T细胞的耗竭。首先，我们将Exh-Pre和Exh-Prog细胞进行转录组的差异比较分析。结果发现d8样本中的Exh-Pre细胞相比于d15样本的Exh-Prog细胞表达量增加了将近1000个基因，而d8样本的Exh-Prog和d15样本的Exh-Prog细胞之间的转录图谱没有太大的差异。对这些差异基因进行生物学通路富集分析，结果发现Exh-Pre细胞的差异基因主要富集到细胞代谢和线粒体功能相关的通路，表明d8时期的Exh-Pre细胞处于一种高度激活的状态。同时，我们还发现这些生物学通路在Exh-Pre向Exh-Prog细胞转化的过程中减弱，并且蛋白质翻译的生物学通路也减弱了。因为蛋白质翻译过程是一个极度耗能的细胞活动，因此在Tex细胞中维持高水平细胞活性可能具有一定的挑战性。我们使用了一种体外蛋白质翻译的实验来测量荧光标记的氨基酸类似物l-高炔丙基甘氨酸（HPG）的水平来评估蛋白翻译活动从d8到d15的变化。在d8时期，来自慢性感染Cl13中的Exh-Pre细胞比来自急性感染Arm的MP细胞具有显著更高的HPG掺入（图7c）。然而，到Cl13中的d15时期，该HPG信号在Exh-Prog细胞中显著降低(图7c)。这些数据表明，尽管在慢性感染期间存在抗原的持续性刺激，但Exh-Pre向Exh-Prog细胞转变的一个主要特征是抑制细胞代谢和蛋白质翻译活动。因此，建立一个与强持续性刺激并列的更静止的状态对于确保T细胞在慢性感染中的持久性可能是必要的。相比于scRNA-seq数据中发现的Exh-Pre细胞中具有增强的蛋白质翻译活性，我们在scATAC-seq数据中发现d15天的Exh-Prog细胞相较于d8天的Exh-Pre细胞有着更多的ACRs区域（图7d）。在一些基因座位处具有多个DACRs，包括Fos、Fosb、Dusp1、Tnfaip3和Btg1等(图7e)。鉴于AP1家族成员基因在T细胞衰竭和效应功能中发挥的重要作用，它们是值得注意的。已知Tnfaip3通过抑制NFkB来调节效应CD8 T细胞的功能。值得注意的是，Btg1是一个令人感兴趣的基因，因为它具有在细胞压力下维持体内平衡的作用，包括造血干细胞在增殖后恢复静息状态。
最后，为了测试Btg1是否在Tex细胞的分化中起作用，我们使用了逆转录病毒(RV)介导的shRNA敲除(KD)(图7f和图S5)技术。我们使用RV编码靶向Btg1或Krt8(一个不相关的对照基因；Ctrl )，然后双重过继转移到用Cl13感染的同源小鼠中(图7f)。尽管在输入群体中靶向Ctrl与Btg1的细胞的混合物是相等的(图7g)，但Btg1 KD后导致d8时期的Tex细胞显著减少(图7h-i)。上述分析结果表明，Btg1在调节从慢性感染第一周出现的高度刺激的Exh-Pre群体向d15天出现的更“受调节”的Exh-Prog群体的转变过程中发挥着重要的作用。在这里，我们发现Btg1 KD在感染后的第8天就有深远的影响。总之，这些结果表明这种细胞应激反应基因在早期Tex细胞产生的过程中，和从衰竭的早期阶段向已建立Tex细胞的形成转变中起着关键的作用。这些数据还表明，Btg1和相关的细胞应激反应基因可能是调节Tex细胞群体的有吸引力的治疗靶点。
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Figure 7. Transition from Exh-Pre to Exh-Prog uncovers Btg1 as a novel regulator of TEXdifferentiation
总结
在本研究中，我们使用LCMV小鼠模型构建了CD8 T细胞不同细胞亚群Teff、Tmem和Tex细胞的分化途径，并对不同分化时间点的T细胞进行了单细胞scRNA-seq和scATAC-seq测序分析，以研究转录组和表观遗传学定义的细胞亚群异质性和潜在的分子发育途径。这些分析揭示了几个关键的结果。首先，与scRNA-seq数据相比，scATAC-seq数据鉴定到了更少的细胞簇，表明多种不同转录状态细胞可以在更少数量的表观遗传特征的细胞中存在。由于不同细胞类型的基因表达模式(如细胞活化或细胞周期)趋同，基因表达在确定细胞身份时可能分辨率较低。这些数据支持了染色质可及性分布更适合于定义细胞“命运”的观点。第二，这些数据揭示了Teff、Tmem和Tex细胞的新亚群，包括表达NK细胞受体的Tex亚群(Exh-KLR)和以细胞溶解毒性潜能区分的早期Tmem亚群(Mem-CTL)。第三，分析PD1途径阻断后的染色质可及性数据揭示了Tex细胞亚群之间的转变，包括以牺牲Exh-KLR亚群为代价的Exh-Int亚群的优先扩展，以及用新细胞重新填充更多终末Tex亚群的证据。第四，我们在慢性和急性感染模型中鉴定到了多个表观遗传学上不同的TCF1+ CD8 T细胞群。虽然这些TCF1+细胞群体中的一些具有共同的转录特征，但它们带有独特的染色质可及性景观，随着时间的推移进一步进化为Tmem和Tex细胞。最后，我们鉴定了细胞应激反应基因Btg1，它是CD8 T细胞衰竭的一个新的调节因子。总的来说，通过构建CD8 T细胞的单细胞转录组和染色质可及性景观图谱，我们提供了CD8 T细胞发育生物学和调控Teff、Tmem和Tex细胞形成的潜在分子机制的新见解，并可能有助于在未来免疫治疗策略中鉴定特殊的治疗靶点或生物学通路。
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