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导读
神经生理学研究依赖于对神经元是否以及何时对刺激作出反应的可靠性量化。确定响应的方法需要任意参数选择，比如分箱大小，而更高级的基于模型的方法需要拟合和超参数调优。这些参数的选择可能会改变结果，从而导致统计实践较差并降低可复制性。研究者提出了无参数ZETA检验，这种检验方法优于t检验、方差分析和基于更新过程的方法。研究者展示了该程序在整个脑区的运行和记录技术，包括钙成像和神经像素数据。此外，为了说明该方法，研究者以小鼠视觉皮层为例，结果显示：(1)视觉运动错配和空间位置是由不同的神经元亚群编码的，(2)VIP(血管活性肠肽)细胞的光遗传刺激导致早期抑制和后期的去抑制。
前 言
许多神经科学研究依赖于神经元尖峰信号的分析和可视化。许多经典的研究在实验过程中使用手动筛选来选择用于分析的细胞，但这种方法不能提供统计上的无偏样本，而且这种手动整理不适合大规模记录技术，如神经像素和高密度多电极阵列。
尽管神经元响应分析得到了广泛的应用，但神经科学目前缺乏一个标准的实践来确定神经元是否对实验刺激或治疗有反应。另一方面，计算刺激前后时间直方图(PSTH)和应用方差分析等方法需要对任意分箱窗口大小进行先验选择。选择错误的箱子大小会降低测试的灵敏度，而从窗口大小范围进行优化会产生多重比较问题。当应用校正时，会降低方法的统计功效，如果结果没有被校正，则会导致(无意识的) p-hacking。虽然基于(点模式)模型的方法可以规避上述许多问题，但仍然需要先验选择或调整特定于细胞类别，甚至单个神经元的统计属性的超参数。因此，许多基于模型的方法不太适合对使用最新技术记录的大规模数据进行无监督分析。
为了解决这些问题，研究者开发了一种方法，以统计稳健的方式检测细胞是否对刺激作出反应，同时避免分箱和参数选择。研究者将这种方法称之为ZETA(基于事件锁时异常的峰值)，在所有测试条件下都能匹配或优于t检验、方差分析和基于点模式的方法。在此框架的基础上，研究者提出了一个程序，无需分箱即可显示瞬时尖峰速率，并且展示了如何使用此程序以亚毫秒级的精度估算峰值活动潜伏期。研究者将这种方法应用于Allen脑研究所的神经像素数据，发现小鼠视觉皮层中VIP表达细胞的光遗传刺激对局部神经回路具有不同的早期抑制和晚期去抑制作用。研究者认为ZETA-检验将成为各学科广泛应用的有用资源。
图1.ZETA-检验检测V1中的视觉响应神经元。
材料和方法
ZETA：关于ZETA检验方法，在Matlab和Python中用代码实现，可以在以下网址获得：https://github.com/JorritMontijn/ZETA和https://github.com/JorritMontijn/zetapy。
结果
ZETA：基于事件锁时异常的峰值
预处理神经数据的常用步骤是去除对实验刺激无反应的细胞。许多实验人员通过比较细胞在有刺激和没有刺激时的平均尖峰速率来确定细胞的“刺激响应性”（例如V1细胞，见图1A-C）。该过程会去除无反应的神经元和对刺激有强烈且复杂的锁时反应的神经元。为了弥补这一不足，研究者开发了一种无分箱的方法来确定神经元是否显示出锁时调制。研究者将这种统计检验称为ZETA，即基于事件的锁时异常(图1D-F)，表示如果一个神经元的尖峰队列对实验者感兴趣的事件没有反应，它是否可以被偶然观察到：例如，视觉刺激的呈现，光遗传刺激的开始等。
通过执行以下步骤在单个细胞上计算ZETA。首先，将所有尖峰与刺激开始对齐（图1A）。汇集所有试次中的尖峰，获得相对于刺激开始的尖峰时间的单一向量，并计算时间函数的累积分布（图1D）。该线性基线的曲线偏差表示相对于非调制尖峰率，神经元的尖峰密度是更高还是更低（图1E，蓝色）。通过抖动刺激开始时间来运行多个引导程序以生成零假设分布（图1E，灰色），将这种模式与偶然观察它的可能性进行比较。在将实验观测曲线缩放到零假设分布的变化之后，用它来获得对应于基于事件锁时异常峰值的p值。低ZETA-检验p值表明，如果神经元不受感兴趣事件的调节，则神经元的放电模式在统计学上不太可能被观察到。
ZETA检验与其他用于推断神经元刺激响应的方法，主要区别在于：ZETA检验没有对时间调制的潜在分布做出先验假设，而且无需分箱。因此，它可以检测到平均放电率的长时间尺度变化，以及相对于刺激开始的任何时间点的短时间尺度的刺激锁定突发或活动中断。
对ZETA检验进行基准测试
使用基准测试比较开始抖动和非抖动数据(图2)。在非抖动情况下，将ZETA检验的包含率与均值t-检验的包含率进行了比较。如果一个细胞被t-检验检测到有视觉反应，那么几乎可以确定它也可以被ZETA检验检测到。接下来，研究者再次运行相同的测试，在-τ和+τ之间随机抖动刺激起始时间，其中τ是持续时间的中值。这个过程保留了神经元尖峰队列的特性，但抵消了对刺激反应的锁定（图2D）。如果ZETA-检验总是呈现较低的p值，那么这将导致较高的假阳性率。相反，ZETA-检验的假阳性率普遍较低，并且与α=0.05的显著性水平一致（图2E–F）。
图2.V1神经元（n=119）的ZETA-检验优于t-检验。
ZETA的灵敏度优于T-检验
研究者使用多种技术（神经像素，n=8；神经鞘，n=2；GCaMP6，n=1；pMEA，n=1）对不同视觉区域（V1，AM，PM，LGN，SC，LP，NOT，APN，视网膜）的n=12种技术所获得的单细胞活动进行了该基准测试，以响应闪光（视网膜，n=1）或漂移光栅（其他，n=11）。在α=0.05的显著性水平下，ZETA-检验的包含率为79%，均值t-检验的包含率为64%；ZETA的t-检验与平均t-检验包含率：n=12个数据集，p=2.8×10-7（图1G和3）。这意味着ZETA-检验包括42%未被t-检验包括的细胞。而且ZETA检验显示出比t-检验更高的统计灵敏度，并且这种差异具有统计学意义。此外，研究者还对从更新过程和泊松过程模型的理论框架派生的各种版本的检验进行了基准测试。这些模型都没有达到ZETA-检验的统计功效和计算效率（图3）。
图3.ZETA-检验较好的灵敏度与大脑区域无关。
ZETA的灵敏度优于具有最佳箱宽的ANOVA
研究者使用专门为构建刺激前后时间直方图（PSTH）而设计的Shimazaki＆Shinomoto方法计算了最佳箱宽，并重复上述基准测试。将ZETA检验与t-检验，ANOVAs和基于更新过程的检验进行比较，结果表明，不管重复试次的次数、数据记录的脑区或数据准备的细节如何，无箱ZETA检验具有优于所有替代检验的统计灵敏度。
确定ZETA-检验在真实神经数据中表现良好后，研究者试图找出ZETA-检验失败的条件。研究者模拟了泊松尖峰人工神经元，结果发现，t-检验的ROC曲线下面积（AUC）仅取决于尖峰率差异（dHz，dHz≠0），ZETA检验在尖峰计数没有差异时也能很好地进行区分，但存在时间上的不连续性（图4A）。当刺激呈现（Tr）=1.0时，虽然t-检验比ZETA检验表现更好，但ZETA检验仍然是不错的（图4B）。虽然从理论角度考虑这种情况是很重要的，但大脑中可能不存在纯泊松尖峰神经元。总之，即使在研究者专门构建用于研究ZETA检验极限的假设情景中，ZETA检验也能接近于t-检验（图4B4）。重要的是，在细胞强烈活跃的情况下（图4F），ZETA-检验明显优于t-检验。
图4.仅在纯泊松分布尖峰计数的假设情况下，t-检验超过ZETA检验的性能。
神经元对自然电影的反应
使用神经像素在3只小鼠的7个视觉脑区中记录单细胞数据，同时给动物播放重复的20s长的自然电影。总的来说，无分箱和无时间尺度的ZETA检验的表现和在不同时间尺度分箱的ANOVA一样好。
图5.神经元对自然电影的反应。
此外，基于瞬时放电率（IFR）的精度取代了基于PSTH（和基于乘性非齐次马尔可夫区间MIMI）的精度，无需为PSTH方法手动选择每个神经元的最佳分箱宽度，也不需要调整MIMI方法的超参数。
图6.源于ZETA的IFR避免了分箱，并且比PSTH更准确的确定潜伏期。
许多神经元的功能特化可以编码视觉运动错配信号或空间位置，但不能同时编码两者。虽然位置和错配编码也可能由中间神经元的特定遗传亚型介导，但研究者对假定的锥体细胞的分析表明，主细胞也显示出编码特化。
图7.V1中的神经元编码视觉运动错配信号或空间位置。
VIP细胞的光遗传刺激解除对视觉皮层的抑制
在小鼠视觉皮层中VIP表达细胞的光遗传刺激在不同的神经元亚群中引起短潜伏期抑制和长潜伏期去抑制（见图8）。
图8
结 论
与基于分箱的PSTH，t-检验，基于马尔可夫模型的方法以及广泛用于神经科学的ANOVA相比，IFR和ZETA检验更简单，更具统计功效，且更不容易出错。统计功效不高的研究在神经科学中仍然很常见，这使得统计敏感工具的开发尤为重要。此外，当使用功效分析来确定必要的样本量时，增加统计灵敏度（例如ZETA检验）可以减少所需实验动物的数量。为了促进神经科学领域采用ZETA-检验，研究者提供了开源代码可分别在MATLAB和Python上获取：
https://github.com/JorritMontijn/ZETA，
https://github.com/JorritMontijn/zetapy
原文：A parameter-free statistical test for neuronal responsiveness.
DOI: https://doi.org/10.7554/eLife.71969
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