单细胞测序scRNA-seq技术学习笔记（二）——生信分析流程思

• 本文为学习笔记，总结自网络资料
• 仅作学习交流用途，严禁用于商业用途
  Jupyter Notebook中的程序运行笔记：https://nbviewer.jupyter.org/github/BioAIEvolu/Learning_R/blob/master/scRNA-seq_analyse.ipynb

流程概述

• 数据下载
• 数据整理
  数据格式：行名是基因名， 列名是样例名
• 质控和数据过滤
  过滤掉检测到细胞数目太少，基因太少的数据
• PCA分析
  传统线性降维方法
  优点：运行速度快
• TSNE分析
  新的非线性降维方法，保留更加有代表性的属性信息，更能体现细胞间的差异
  缺点：运行速度慢
  找到基因的聚类cluster，将表达相关的基因聚集在一起
• Marker基因
  类似
• 注释细胞类型
  • 软件
  • 文献
  • 结合分析经验
• 细胞轨迹分析
  哪些细胞先出现，哪些细胞后出现，分析细胞的分化过程和程度
• GO 富集分析和圈图
  功能和通路的富集
• KEGG 富集分析和圈图
  功能和通路的富集

具体操作

一、数据下载

NCBI选择GEO数据库
GEO数据库主页

二、数据整理，得到矩阵

数据整理，得到矩阵
样本基因数目矩阵

三、质控与数据过滤

3.1 质控

质控：小提琴图

• 去掉游离的点的值
• 样本量大-->点的跨度大-->可以放宽筛选条件

• 过滤掉线粒体基因

  
  测序深度vs线粒体百分比
  

  此图中，因为线粒体基因都被过滤掉，所以线粒体基因数为0，测序深度与线粒体百分比没有关系

  
  测序深度vs基因数目
• 此图显示，基因数目与测序深度呈现正相关关系，相关系数为0.63（相关性较高）
• 随着测序深度增大，基因数目也会趋向于饱和

3.2 数据过滤

基因在所有细胞的表达量波动情况

• 基因在所有细胞的表达量波动程度
  • 由于我们后续需要做PCA和TSNE的聚类分析，所以需要筛选出那些在所有样品里面表达量波动比较大的基因（红色的点），以便于找出细胞间的差异
  • 此处挑选了1500个基因，并标注好波动最大的前10个基因的名称

四、PCA主成分分析

PCA主成分分析

• 得到每个PC（主成分）相关对的基因
  • 绝对值越大 相关性越大
  • 这里是挑选了那些与主成分相关性较大的基因 也就是每个PC所对应的基因

数据降维：

• 1500个基因对应着1500维的是数据，需要降维后才能画图

• 降维到20个PC

• 降维后的到PC1和PC2等

• 做综合性的考虑。例如对PC1和PC2，画一个PC1和PC2关系图

  
  PCA图

• 每个点代表一个细胞

• 一种颜色代表一个样品

绘制PCA热图

PCA热图
PCA热图

• 基因在所有细胞里面的表达谱情况
• 黄色代表高表达的情况

由于TSNE聚类分析时需要筛选PC，需要对PCA得到的结果进一步筛选，但是PCA又不能选择地太少（会使得全部基因的信息量丢失），选择一个折中的方法，通过图形选择那些p-value小于0.05的关键PC：

此处选择了p-value小于0.05的20个PC

PCA主成分分析 主成分的p值

• 每一条曲线代表一个主成分PC，相当于一个基因的集合
• 1500个PC降维到20个PC
• 20个PC进行数据转换，就能代表原本1500个PC的信息量
• p值：实际PC中的一个关键基因的数目与理论PC中可能存在的基因数目的差异
• 所以，PC的p值越小，意味着得到的关键基因越多，即这个PC越重要——p-value越小，PC越重要

五、tSNE聚类分析

tSNE聚类分析

• 对细胞进行聚类，总共有15个cluster

• 其中cluster 10为B细胞（后续做差异找Marker、GO、KEGG都是针对这个cluster）

  
  每个样品的cluster
• 表格展示哪些细胞属于哪些cluster

聚类热图：

聚类热图

• 黄色代表高表达，cluser的黄色区域对应的基因代表着此cluster的Marker基因
• 只是对最主要的Marker基因进行了图形化

六、marker基因

寻找marker基因
Marker基因的判定标准：

• 调整后的p值＜0.05
• avg_logFC的绝对值 > 0.5 （至少1.5倍的差异）
  • 一般转录组分析的时候，avg_logFC的绝对值 > 1
  • 由于此处是肿瘤细胞，avg_logFC的绝对值 > 1得到的基因数目会太少，所以需要avg_logFC的绝对值 > 0.5得到差异基因

此处针对以cluster10，即B细胞的差异（Marker）基因进行分析：
选出两个基因进行绘图（其中横坐标为各个cluster，纵坐标为对应基因的表达水平）

marker基因的小提琴图

绘制聚类图展示查看差异情况：

注意B细胞聚类cluster10的位置，红色方向表示基因的高表达

marker基因在各个cluster的散点图

绘制气泡图展示查看差异情况：

marker在各个cluster的气泡图

其中，横坐标代表cluster10的Marker基因，纵坐标代表各个cluster
结论：

1. 前五个基因，在cluster10中的表达是上调的
2. 后五个基因，在cluster10中的表达是下调的

七、注释细胞类型

这部非常难

注释细胞类型

注释的方法：

• 软件（一个R包）预测
• 结合文献
• 结合被测序的细胞、组织、肿瘤类型进行注释

可能有多个cluster被注释上相同的细胞类型

八、细胞轨迹分析

这步也非常难

对cluster做的细胞轨迹分析
对注释出的细胞类型做的细胞轨迹分析

其中：

• 每个点代表一个细胞
• 一种颜色代表一种聚类
• 数字表示分支点

需要根据软件预测、经验、文献、对这个细胞测序过程的理解，判断哪个细胞可能在前面分化出来

有经验的情况的分析思路：
根据前面打的研究、经验，知道哪种细胞在肿瘤中最先出现，预判细胞轨迹的起点（树根）

没有经验，不知道细胞出现先后的分析思路：
猜测：细胞种类单一、数量较少 ---分化---> 细胞种类多，数量多

九、GO功能富集

对Marker基因进行GO分析

基因名字转换基因id

基因名字转换基因id

• 此处挑选了cluster10 B细胞的Marker基因进行分析
• 在原本Marker基因的基因名、avg_logFC的两列情况下，增加一列基因转换的ID entrezID，以便于后面R包的使用
  GO富集分析
• 得到的结果，都富集到B细胞、跟免疫相关的功能通路也很多，说明实验和分析都做得很好
• 红色越深，富集越显著
• 柱子长度或圆圈大小，代表基因的数目
• 放一个图即可
  圈图
  GO圈图
  发文章的时候用左边的图更直观

十、KEGG通路富集

KEGG通路富集

• 柱状图横坐标代表基因数目，气泡图表示基因的比例
• 气泡图中圆圈大小，代表富集到每个通路上基因的数目
• 纵坐标代表通路名称
• 颜色越红，在该通路上富集的显著性越高
  KEGG圈图：
  KEGG圈图

• 学习自“生信自学网”等网站