5月5日，山东师范大学王宝山团队，在Molecular Plant（IF: 13.16）杂志发表了题为“The genome of the recretohalophyteLimonium bicolorprovides insights into salt gland development and salinity adaptation during terrestrial evolution”的研究论文，该研究报道了二色补血草高质量基因组序列，并揭示了泌盐植物进化和盐腺发育相关分子机制。山东师范大学王宝山教授为论文通讯作者，袁芳副教授为第一作者，在读博士生王茜、硕士生赵博庆、徐晓静、史淼博士为共同第一作者。
一、研究背景
植物通过进化出各种机制来应对高盐分的毒害，如拟南芥和水稻通过Na+/H+转运蛋白，可以降低细胞质中的Na+含量，而高亲和钾离子转运蛋白1（HKT1），可以在木质部中卸载Na+。盐生植物还进化出其他独特的特征，以适应高盐度环境。例如，一些泌盐盐生植物利用地上组织表皮上的盐腺分泌有害离子，以避免细胞遭受盐毒害。
然而，由于缺乏盐腺物种的基因组资源，盐腺发育的分子机制尚不清楚。揭示泌盐盐生植物盐腺的分子进化史可能有助于解释这些生物是如何处理应对高盐环境的。
二色补血草（Limonium bicolor），补血草属（白花丹科），是一种二倍体泌盐盐生植物。在紫外（UV）光照射下，二色补血草的盐腺会发出自发荧光，利于荧光观察和突变体的筛选，是研究泌盐盐生植物盐腺发育最理想的材料。文章将通过构建二色补血草高质量基因组，从而探索其进化史和盐腺的发育起源。
图1 二色补血草（图片引自文献[1]）
二、技术路线
本研究使用Illumina短序列和PacBio SMRT测序数据、Hi-C测序数据和Bionano基因组图谱相结合的方法，对二色补血草基因组进行了测序和组装，生成了二色补血草高质量基因组。随后文章结合转录组学分析、基因编辑技术、扫描电镜（ESEM）技术和能量色散光谱（EDS）分析候选基因，并对盐腺发育的分子机制做进一步验证，揭示盐腺发育对二色补血草泌盐机制的影响。
技术路线如下：
三、主要结果
1.二色补血草基因组组装
文章首先利用二代测序数据对二色补血草基因组大小进行Survey评估，随后使用PacBio SMRT三代测序技术，并结合Hi-C测序数据和Bionano测序数据，组装了二色补血草基因组（最终大小约为2.92 Gb）。接着，文章对生成的八对假染色体（长度范围为136至540 MB）组装序列进行分析，发现约2.82 Gb的序列（占基因组大小的96.4%）被比对至组装序列上，数据回比率为97.8%。随后文章对组装结果进行BUSCO评估，结果为84.4%，表明二色补血草的组装的质量和完整性相对较高。
图2 二色补血草基因组特征（图片引自文献[1]）
2. 二色补血草比较基因组学研究
文章首先进行了比较基因组学分析，选择了三种典型的蔷薇属植物、三种菊科植物以及四种石竹，并使用玉米（Zea mays）为外类群，利用1078个单拷贝基因家族的数据构建了系统发育树，结果表明二色补血草与F. tataricum关系最为密切。
随后文章使用McscanX和PAML-Yn00对同源基因对的Ks值进行分析，以了解二色补血草是否经历过全基因组复制（WGD）事件。结果表明，二色补血草中同源基因对之间的Ks值显示出双峰分布，但二色补血草和F. tataricum之间的Ks值无差异，表明二色补血草与F. tataricum基因组可能在进化过程中发生了相同的全基因组复制事件。接着，文章对二色补血草和F. tataricum进行共线性分析，发现由于二者基因组大小差异较大（大小分别为2.92 Gb和454 Mb），二者无明显共线性关系。
图3 二色补血草基因组进化关系、全基因组复制事件和共线性分析（图片引自文献[1]）
3. 筛选盐腺发育与泌盐机制相关候选基因
文章继续收集不同发育阶段的叶片样本，进行RNA-seq分析，随后通过对差异表达基因进行GO富集分析，发现差异表达基因主要与生物水解、染色质沉默、核小体组装、盐胁迫反应、信号转导和转运体/通道活性有关。同时，有3095个呈上调表达趋势的基因可能参与盐腺分化过程。
接着文章将一个月大的植株培养于200 mM NaCl中，并在0（水对照）、12、24、48和72 h高盐培养条件后收集叶片（此时叶片上可观察到盐晶体）进行RNA-seq分析，进一步筛选了6372个与泌盐相关差异表达基因，这些基因可以作为泌盐机制相关的候选基因，它们可能参与了渗透和离子胁迫反应。
图4 叶片发育过程中差异表达基因聚类和功能富集分析（图片引自文献[1]）
4. 毛状体发育同源基因LbTTG1和LbHLH参与二色补血草盐腺的发育
为了确定二色补血草植株中是否存在毛状体发育过程，文章通过与拟南芥毛状体发育基因相比对的方法，筛选拟南芥bHLH因子和TTG1同源基因，接着通过荧光原位杂交证实LbTTG1和LbHLH均在盐腺中表达。随后通过基因编辑技术构建突变体和过量表达植株，并对不同植株盐腺发育情况进行观察，发现LbTTG1和LbHLH突变株的盐腺密度与野生型相比增高，而LbTTG1和LbHLH过表达植株的盐腺密度则降低，且其盐腺形态也明显受到影响。上述结果表明，LbTTG1和LbHLH影响了盐腺的密度和外观，证实其参与了盐腺的发育。此外，在二色补血草植株中LbTTG1和LbHLH蛋白在盐腺发育中可能起到了负调控作用。
图5 二色补血草LbTTG1和LbHLH过表达或敲除植株中盐腺发育情况和Na+流通率（图片引自文献[1]）
随后文章对植株盐腺中钠离子流通量进行鉴定，发现LbTTG1和LbHLH突变体的大盐腺比野生型品系的盐腺表现出更高的Na+流出率，而LbTTG1和LbHLH过量表达植株的小盐腺具较低的Na+流出率，说明LbTTG1和LbHLH可能参与了盐分泌。接着文章还对各品系的盐损伤。情况进行观察，结果表明，促进盐腺发育的LbTTG1和LbHLH的缺失，可增加植株盐分泌和耐盐性。
5. 二色补血草关键调节因子LbHLH不能替代GL3在拟南芥中诱导毛状体发育
最后，文章对LbHLH是否可以替代拟南芥GL3来诱导毛状体发育进行测试。发现LbHLH的异源表达未能促进GL3单一突变体植株中毛状体的形成，表明LbHLH不能替代拟南芥GL3。此外，与拟南芥GL3相比，LbHLH功能被阻断或修饰可导致二色补血草植株中无毛状体，同时抑制盐腺分化。
图6 二色补血草LbHLH和拟南芥GL3相关分子机制（图片引自文献[1]）
四、研究结论
本研究提供了二色补血草的基因组资源，将有助于理解泌盐植物进化和盐腺发育的分子机制，从而协助筛选与非生物环境胁迫相关的抗性基因，弥补了泌盐盐生植物盐腺发育机制的空白。同时文章揭示了LbTTG1和LbHLH对盐腺启动的作用，并强调二色补血草中LbTTG1和LbHLH对盐腺体的分化具有负调节作用，为相关研究提供了新的见解。
参考文献
1. Yuan Fang, Wang Xi, Zhao Boqing et al. The genome of the recretohalophyteLimonium bicolorprovides insights into salt gland development and salinity adaptation during terrestrial evolution[J]. Mol Plant, 2022.
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