ScRNA-seq的原理是什么？它在肿瘤研究中的应用有哪些？你想知道的这些问题这里都有。今天就来给大家分享一篇关于scRNA-seq在癌症研究中的应用的综述。文章今年发表于《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》（IF：11.161）上。
scRNA-seq在癌症研究中的应用
内容概述
这篇综述的主要内容包括以下几个方面：
（1）scRNA-seq概述；
（2）scRNA-seq在肿瘤异质性中的应用；
（3）scRNA-seq在免疫细胞分型中的应用；
（4）scRNA-seq在免疫逃逸中的应用；
（5）scRNA-seq在细胞通讯中的应用。
接下来我们结合综述内容看看以上五个方面的具体内容又是哪些。
背景
肿瘤的发展是一个复杂的、多阶段的过程。在肿瘤发生发展过程中，肿瘤细胞内部的众多生物学或遗传差异将导致形成复杂的肿瘤异质性。scRNA-seq技术可以单细胞分辨率测量整个转录组并区分肿瘤组织中的不同细胞类型，克服了传统RNA测序方法的局限性。可以更清楚地了解促进肿瘤发生的分子机制，并揭示整个肿瘤进化过程中的体细胞突变、识别关键突变基因、检测肿瘤异质性随时间的动态变化以及结合免疫检查点靶向治疗。目前，scRNA-seq已成为肿瘤研究的重要技术工具。
内容
1.scRNA-seq概述
scRNA-seq 包括四个步骤：(1)单细胞的分离，(2) 逆转录，(3) cDNA扩增，和 (4) 测序文库构建（图1）。这个过程有两个主要问题：一是逆转录过程中RNA的损失必须最小化；其次，扩增过程应产生尽可能多的DNA 用于测序并减少噪音的影响。单细胞的分离方法主要包括手动细胞选择法、随机接种/稀释、激光捕获显微切割技术（LCM）、流式细胞分选（FACS）和微流体/微滴技术。其中FACS是最常用的方法。逆转录和cDNA扩增是提高scRNA-seq灵敏度和准确性的重要步骤。比较常用的方法主要有三种：在RNA上加poly(A)然后进行PCR法、IVT法以及MMLV逆转录酶法。在Smart-seq中，RNA被莫洛尼小鼠白血病病毒 (MMLV)逆转录，其测序范围可达全长cDNA，因此这种方法具有更高的灵敏度和准确度。STRT-seq和STRT/C1-seq在Smart-seq的基础上引入UMI，并在5'端用生物素进行标记，进一步提高了灵敏度和准确性，但这种方法具有很强的5'端偏差。目前scRNA-seq的主流商业平台主要是10X Genomics和BD Rhapsody。
不但数据本身的质量很重要，其实scRNA-seq的数据处理方法也很重要。目前比较常用的scRNA-seq数据处理方法主要包括Seurat、Monocle、Scanpy、Linnorm等。这些算法可用于数据的质控、基因表达标准化以及降维聚类。在此之后，可以通过选择不同的算法语言包进行更加详细的功能分析，例如marker基因识别、细胞类型识别、亚组分析和拟时间分析等。其中，Seurat一个功能强大的用于scRNA-seq数据的R包，细胞质控、聚类及差异分析等这些分析都可以通过这个包来实现。与Seurat不同，Monocle是一种比较新颖的无监督算法；Scanpy是一个基于Python的工具包，包括数据预处理、结果可视化、聚类分析、拟时间分析、差异表达分析和基因调控网络分析等功能。文中还提到了一些其他的方法，包括有Linnorm、NODES、SAMstrt、SCnorm、scran、DESeq和TMM等。
除了scRNA-seq技术本身，作者还提到了一些单细胞转录组与其他研究领域相结合的新技术。如CITE-seq——将转录组学与细胞表型研究相结合；CROP-seq——将CRISPR技术与 scRNA-seq 结合。
图1 五种scRNA-seq方法概述示意图
2.scRNA-seq在肿瘤异质性中的应用
目前被广泛认可的一种观点是肿瘤的发生是体细胞突变积累的结果。体细胞突变主要包括基因突变异质性（碱基对置换、插入和缺失）和基因组不稳定性（染色体不稳定性、染色体重排、拷贝数变异和微卫星不稳定性）。研究发现，许多肿瘤的发生发展都与癌基因的突变有关。
scRNA-seq可用于研究肿瘤发生发展的各个阶段的遗传学和分子特征，包括从正常状态到癌前病变到肿瘤浸润再到肿瘤转移（图2）。在正常组织细胞中， scRNA-seq可以用来构建细胞的转录组图谱，量化细胞的恶性突变和恶性程度。在癌前病变阶段，scRNA-seq可以用于检测由于基因组不稳定性而造成的突变，可用于早期癌症诊断，以便及时干预并阻止癌症的进一步发展。进入肿瘤发展中期阶段，scRNA-seq可用于检测肿瘤恶性程度并预测肿瘤转移的可能性，若再结合临床治疗，可以有效的阻止肿瘤转移的发生。此外，在肿瘤转移阶段，scRNA-seq可用于分析肿瘤转移细胞的异质性包括肿瘤组织的细胞分型，结合肿瘤微环境和遗传因素的影响分析恶性肿瘤特征细胞的状态，为靶向治疗提供了机会。
在这里，作者还提到了将scRNA-seq与表观遗传学联系起来的一些技术。如scATAC-seq技术，可用于分析单个细胞的染色质可及性。还有scNMT-seq，可以在单个细胞层面并行实现染色质可及性、DNA甲基化和转录组综合分析。尽管目前scRNA-seq在肿瘤异质性研究中的应用还有很多需要解决的问题，但其仍然有很好的应用前景。
图2 scRNA-seq在肿瘤发生中的应用
3.scRNA-seq 和免疫细胞分型
肿瘤异质性包括很多方面，其中免疫异质性是一个重要方面，它与耐药性和免疫治疗有关。首先我们来了解一下肿瘤组织中所包含的成分，主要分为两大类，一是先天免疫细胞，包括有树突细胞 (DC)、未成熟树突细胞 (iDC)、活化树突细胞 (aDC)、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞、肥大细胞，巨噬细胞，自然杀伤细胞（NK细胞）；二是适应性免疫细胞，如T辅助细胞 Th1 和 Th2、调节性 T 细胞 (Treg)、CD8 + T 细胞、中枢记忆 T 细胞 (Tcm)、记忆效应 T 细胞 (Tem)、T 滤泡辅助细胞 (Tfh) 和 γδ T 细胞等（图3）。
图3 免疫细胞分型
免疫异质性体现在免疫浸润程度和免疫细胞类型上。不同肿瘤类型和癌症发展阶段的患者存在明显的个体差异性。许多研究表明，肿瘤组织中T细胞浸润的程度与患者的生存和免疫治疗密切相关。一般来说，CD8+ T细胞的浸润程度越高，预后越好；而Treg细胞则具有相反的作用，肿瘤中Treg细胞的数量与免疫治疗的敏感性呈负相关。
scRNA-seq可用于对肿瘤细胞进行准确分类，能够分析不同肿瘤浸润免疫细胞的具体特征，从而设计靶向治疗方案和改进免疫疗法，以达到更好和更广泛的临床治疗效果。
4.scRNA-seq和免疫逃逸
免疫系统有三大功能：免疫监视、免疫应答和免疫记忆。免疫监视通过识别、杀死和消除体内的突变细胞来防止肿瘤的发生。当机体免疫监视功能低下，无法有效清除“异己”成分或突变细胞时，就可能发生肿瘤。通过肿瘤细胞、免疫细胞和肿瘤微环境之间的持续相互作用，肿瘤发展分为三个连续的阶段：消除、平衡和逃逸。
免疫逃逸是目前研究一大热点，scRNA-seq在评估肿瘤免疫逃逸中的应用主要包括以下四个方面：①用于检测和筛选新抗原；②通过 scRNA-seq检测免疫检查点的转录活性并评估ICI耐药机制；③检测MHC突变引起的免疫逃逸；④鉴定不同T细胞内的TCR序列。
图4 scRNA-seq在评估肿瘤免疫逃逸中的应用
5.通过scRNA-seq分析肿瘤细胞间通讯
肿瘤是由异质细胞类型（包括恶性细胞、免疫细胞和基质细胞）之间的相互作用定义的复杂生态系统。每个肿瘤的细胞组成，以及这些成分之间的相互作用，都可能在癌症的发展中起关键作用。不同类型的细胞通过配体-受体相互作用、旁分泌、自分泌等细胞间通讯方式形成复杂的相互作用网络，影响肿瘤的细胞形态、增殖速率、侵袭和转移。scRNA-seq可用于表征肿瘤相关细胞类型的丰度、功能状态以及检测细胞间通讯，分析不同细胞相互作用的关系，以研究肿瘤微环境的病理生理特征，从而预测肿瘤的发展和预后。也为单细胞基因组学在靶向治疗和免疫治疗中的应用提供了新思路。
小结
这篇综述概述了scRNA-seq的原理以及其在肿瘤异质性、发生发展和治疗中的作用，为肿瘤研究的进一步发展提供了新的技术手段，有望在该领域取得重大突破。此外，scRNA-seq技术与多种组学研究相结合，拓展了其在表观遗传学、蛋白质组学等领域的应用。
参考文献
Zhang Y, Wang D, Peng M, Tang L, Ouyang J, Xiong F, Guo C, Tang Y, Zhou Y, Liao Q, Wu X, Wang H, Yu J, Li Y, Li X, Li G, Zeng Z, Tan Y, Xiong W. Single-cell RNA sequencing in cancer research. J Exp Clin Cancer Res. 2021 Mar 1;40(1):81. doi: 10.1186/s13046-021-01874-1. PMID: 33648534; PMCID: PMC7919320.
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