使用Misa结合Primer3来批量设计SSR引物

一、何为 SSR ?

SSR ( simple sequence repeats ) 即简单重复序列，也称为微卫星 DNA(microsatellite DNA )，在真核生物基因组中广泛存在，一般是以1-bp 组成较低程度的重复序列，主要以2-3个核酸为重复单位如(GA)n、(AC)n 和(GAA)n 等。

从进化角度看物种间重复序列的差异是自然选择的结果。因此鉴定SSR在基因组分析中有重要意义。微卫星在原核生物和真核生物基因组中随机分布，而且该标记呈共显性，符合孟德尔遗传模式，易于操作，具有高度重复性和可靠性，显示出较强的多态性等优点，使其在遗传连锁图谱构建、遗传多样性检测、基因定位及分子标记辅助选择等领域有重要应用

SSR 通常可以分为基因组 SSR 和 EST-SSR 两大类。GenomicSSR 是基于基因组序列开发的，开发起来费时费力，而且因为探针的缘故，种类比较局限，EST-SSR是指存在于表达的基因序列内的SSR，不包括存在于内含子及非表达的调控区等之中的SSR，通常三个碱基重复的占多数，与不引起基因翻译过程中移码现象的发生相一致，EST-SSR有更强的种属转移性。不过一般EST-SSR的重复序列要短于基因组中的SSR，而且从EST中筛选的微卫星要比从基因组中筛选的微卫星多态性低。

二、使用 Misa 结合 Primer3 来批量设计 SSR 引物

MISA，英文全称为Micro Satellite identification tool，即微卫星识别工具。
MISA是使用 perl 编写的一支程序，能识别出序列中的微卫星和复合微卫星（两个微卫星之间由由不多于100bp的碱基对隔开），并给出其所在位点。

MISA下载网址：http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html

1. MISA 用法：

misa.pl filename

其中，fastfile是序列文件，同时在运行程序的工作目录下必须有一个名称为“misa.ini”
的文件。该文件内容为：

definition(unit_size,min_repeats): 1-10 2-6 3-5 4-5 5-5 6-5
interruptions(max_difference_for_2_SSRs): 100 

该文件指定了misa的参数，即1个碱基重复10次及10次以上；2个碱基重复6次及6 次以上；
3个碱基重复5次及5次以上；4个碱基重复5次及5次以上；5个碱基重复5 次及5次以上；6碱
基重复5次及5次以上，这样的碱基重复序列才算是微卫星序列。 同时，两个微卫星之间的距离小于100bp的时候，两个微卫星组成一个复合微卫星。

MISA的输出结果：

MISA会在 fastafile 所在的文件夹下生成两个文件，分别是 “.misa” 和 “.statistics”

• .misa：以表格的形式列出微卫星的类型和位点；
• .statistics ：统计微卫星的类型和频数。

在MISA的下载页面中，提供了3个附加的 perl 脚本，分别是：Get_est_trimmer.pl，p3_in.pl 和 p3_out.pl。

由于 MISA 程序读取 fasta 文件中的序列 ID，将序列 ID 中的空格用下划线 ”_” 填补了，所以在fasta文件中，其序列ID最好不要有空格。否则运行接下来的程序时，会出问题。

Get_est_trimmer.pl
针对EST序列，可以除去EST序列中短的序列和两端不明确的碱基。

2.第二步：

p3_in.pl 输入 misa.pl 的输出结果，将引物设计的参数文件（模板，产物长度，目标区域等）导入到一个以“p3in”为后缀的文件中。

p3_in.pl filename.misa

3.第三步：

primer3主设计引物脚本

primer3_core -default_version=1 -output=filename.p3out filename.p3in

4.第四步：

p3_out.pl对primer3产生的文件进行提取合，得到最后的结果文件 filename.result

p3_out.pl filename.p3out filename.misa

tips： p3_in.pl 和 p3_out.pl 这两个程序可能需要修改才能正常使用。

参考：http://www.chenlianfu.com/?p=255

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