刘小泽写于2020.2.20
常见的差异分析第一步往往是去进行标准化处理，那么究竟标准化的对象是什么？怎么根据具体情况去标准化呢？这是难点所在！
首先要熟悉表达矩阵
表达矩阵就是我们上游分析根据比对后的sam/bam文件，利用软件（如转录组的featureCounts）定量的结果。它的格式是：行为基因，列为样本，中间的数值是表达量【例如下图】
标准化需要考虑的三个层面和三个因素
「三个层面」之一：组间样本间比较（两个样本两个组）
它探讨的问题就是：我们想看经过处理后样本的样本变化，原来我这个基因的表达量是10，那么处理后样本中这个基因表达量会下降还是上升或者不变呢？。一般我们希望这个结果有很明显的差异【也就是常说的差异分析】
「三个层面」之二：组内重复样本间比较（两个样本一个组）
它探讨的问题就是：单纯看看处理组的三个重复之间，某个基因有没有差别，好检测一下做的实验误差大不大。一般我们不希望这个结果很明显的差异
「三个层面」之三：组内样本内比较（一个样本一个组）
它探讨的问题就是：我这个组的一个重复样本中的A基因和B基因，哪个表达量更高一些？为什么对于我这个样本，B基因表达量会高于A呢？
首先要了解实验属于哪个层面，然后有的放矢，再去看应该考虑哪些情况
「三种情况」之一：测序深度
如果要比较两个样本的同一个基因表达量，那么首先要保证外部因素一致，最直接的体现就是测序深度。不同批次的测序，它的测序深度可能不同，因此可能导致下面这种情况：
【注意：图中所有红色和绿色的小长条就是比对到基因的测序read，我们也是按它们的数量来判断某个基因表达量的；看到有的长条之间连了一条虚线，这表示它是跨越内含子比对的测序read。我们使用的hisat2就支持这种跨内含子比对】
图中：貌似A样本的所有基因表达量都是B的两倍。但如果A样本本身测序量就大呢？也就是说，A和B的“家底”就不同，不能直接放一起比较，要比也要放在同一水平公正去比
「三种情况」之二：基因长度
如果要比较同一个样本中的不同基因，那么就要处理好“内部矛盾”——基因长度的问题。基因的长度是固定的，如果要比较的两个基因中，一个基因本身就很长，那么理所应当，落在上面的reads数量应该也越多。因此可能导致下面这种情况：
图中： 虽然都位于样本A，但基因X比Y要长，所以比对过程中也有更多的reads落在X上，这样X的获胜很有可能是靠着自己“修长”的身材，而不是靠真正的表达量实力
「三种情况」之三：RNA组成
这种情况也可以理解为：找出搅局者。依然是在组间比较，但可能某个样本中就是存在这样的“异类”：它本身很强大，表达量超级高，拉高了整体的表达量，造成一种“虚假繁荣”。于是当默认按照情况一：测序深度处理时，“异类”的所有小伙伴都要陪着它一起缩小，为了减小所谓的“测序深度影响”。但它的小伙伴亏啊，本来和对照样本中的基因单挑是完胜的，但这一缩减，就不行了【如下图】
图中： 本来样本A中的所有基因都比B要高，即使为了公平起见处理一下测序深度，也很有可能是胜出或者打个平手。但A中出现了一个DE基因（可以理解成表达迥异的基因），它的到来让我们误以为样本A的测序深度很高，于是给A的所有基因都除以了一个值，保证和样本B可比。于是，样本A中除了DE以外的基因，最后都被B的对应基因打败了【A中基因含恨而亡，DE很愧疚】
但你说，这个DE基因怎么来的呢？天生的吗？
有可能是真的存在这种少数特殊基因，就在某个样本中高表达；但还有可能，是出现了样本污染混入的其他基因，它本身不属于样本A，只是过来跑跑龙套，然后带偏了整个结果
因此，在我们进行差异分析时，除了考虑测序深度，还有考虑样本内部组成
好，来看看常见的标准化方法
既然上面👆我们了解了为什么进行标准化以及标准化针对的对象，那么接下来就看看都有什么好办法来完成这个任务，以及它们适用的场景吧！
这里必须要好好感谢一下哈佛的教学人员，整理出来一份很细致的方法对比说明
先上原图
然后我再逐个解读
这些名词其实没必要翻译成中文，因为翻译过来可能更糊涂了。比如FPKM的翻译是：每1百万个map上的reads中map到外显子的每1K个碱基上的Fragments个数。而看它的计算方法其实最直观：
FPKM= read counts / (mapped reads (Millions) * exon length(KB))
CPM (counts per million)
- 主要适用于组内重复样本间比较
- 不适用于：组间样本间比较（也就是差异分析）；组内重复样本间比较
- 主要考虑的是：测序深度
TPM （transcripts per kilobase million）
- 主要适用于：组内重复样本间比较、组内样本内比较
- 不适用于：组间样本间比较（差异分析）
- 主要考虑的是：测序深度和基因长度
RPKM/FPKM
- 主要适用于：组内样本内比较
- 不适用于：组间样本间比较（差异分析）、组内重复样本间比较
- 主要考虑的是：测序深度和基因长度
这就很有意思了，为什么TPM和RPKM都是考虑了测序深度和基因长度，但RPKM却不能进行组内重复样本间比较呢？
这是因为RPKM或者RPKM算出来的标准化后的数值和TPM不同：每个样本中的TPM的总和都是一样的，而FPKM则不相等【先看这篇：标准化进行时】：The total number of RPKM/FPKM normalized counts for each sample will be different.
总和不同当然不能直接进行比较了
DESeq2’s median of ratios
- 主要适用于：组内重复样本间比较、组间样本间比较（差异分析）
- 不适用于：组内样本内比较
- 主要考虑的是：测序深度和RNA组成
EdgeR’s trimmed mean of M values (TMM)
它应该是考虑问题最多的标准化方法
- 适用于：组内重复样本间比较、组间样本间比较（差异分析）、组内样本内比较
- 主要考虑的是：测序深度，基因长度和RNA组成
补充说明
下面是针对一些方法的补充
问题一：RPKM/FPKM
RPKM：以每个Read为一个单位，单端测序常用
FPKM：以Fragment一个单位，主要在双端测序
-
它们的差别是：FPKM在一对reads map上的情况下只计数1，而RPKM会计数2。因此为了准确，PE测序时我们认为一对reads比对上也只算一次，因此使用FPKM
-
一般无参转录组使用RSEM计算的结果，会给出FPKM和TPM两种结果
关于计算方法【难度在于准确计算基因长度】：看：「刘小泽RPKM概念及计算方法」https://www.jianshu.com/p/2bfa2b65a700
问题二：10X单细胞数据中的count需要计算TPM、FPKM等吗？
计算TPM、FPKM的一个原因是：比较一个样本内的两个基因时，担心基因长度会造成影响。
- UMIs enable accurate quantitation of gene expression levels because we can tell when reads are generated from the same mRNA molecule.
- In traditional RNA-seq workflow, the probability of sampling a fragment from a long transcript is higher than from a short one.
- in 10x single cell 3' or 5' gene expression assay, this gene-length bias does not exist.
问题三：还有一种RPM和TPM一样吗？
它们的对比可以看：https://reneshbedre.github.io/blog/expression_units.html
- RPM：Reads per million mapped reads
- TPM：Transcript per million
- TPM proposed as an alternative to RPKM due to inaccuracy in RPKM measurement (Wagner et al., 2012)
RPM不考虑转录本长度，而TPM考虑；不过它和CPM倒是类似（分别是：Reads/Counts of exon model per Million mapped reads）
问题四：FPKM和TPM标准化过程的区别
- FPKM和RPKM：先按列（也就是这个样本的总count值）进行标准化，然后再对每个基因的长度进行标准化
- TPM：先对基因长度进行标准化，之后再对列（此时已经不再是原来count值的简单加和了）进行标准化
问题五：DEseq2的详细标准化方法
看哈佛的讲解，非常详细易懂：https://hbctraining.github.io/DGE_workshop/lessons/02_DGE_count_normalization.html
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Step 1: creates a pseudo-reference sample (row-wise geometric mean)
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Step 2: calculates ratio of each sample to the reference
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Step 3: calculate the normalization factor for each sample (size factor)
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Step 4: calculate the normalized count values using the normalization factor
问题六：如何计算TPM？
偶然看到一篇文章发在了Bioinformatics：https://github.com/ncbi/TPMCalculator
核心内容是：给他bam和GTF，给你算出来结果
另外，各种标准化计算的公式，都非常清楚了写在了：https://reneshbedre.github.io/blog/expression_units.html
可以自己根据公式去探索如何得到其中的每个数【当然好像也有一些R包可以做这个事情，但是需要时间去找、去验证】
其他的资源
视频：RPKM, FPKM and TPM, Clearly Explained!!! （https://www.youtube.com/watch?v=TTUrtCY2k-w）
文章：
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浅谈RPKM,FPKM,RPM,TPM的区别 https://vip.biotrainee.com/d/63-rpkm-fpkm-rpm-tpm
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