前言

今天来跟大家分享一款非常优秀的桌面级的RNAseq定量软件——kallisto。该软可以同时用于bulk and single-cell RNA-Seq 以及一些常见的目标捕获的高通量测序数据的定量。与以往常用的STAR等依赖基因组序列的比对软件不同，kallisto采用一种被称作伪比对(pseudoalignment)的方式直接将测序片段直接比对到cDNA序列然后定量。之所以称kallisto为桌面级软件是因为kallisto能够使用个人笔记本在10分钟内完成一套含有30M reads 的双端RNA-seq数据的定量分析，可谓是名副其实的桌面级分析软件，而且速度也是相当的快。这么好的软件当然要分享给大家一起使用了，下面我们就来看看如何使用该软件做定量。

bulk-RNAseq的定量
首先来看一下如何使用kallisto来做常规RNAseq的定量，只需两步即可，第一步是构建比对参考基因组(该步骤只需做一次，后面可以直接使用)，第二步就是定量(该软件无需单独做一次比对，而是直接将reads比对后定量出结果，在步骤上一气呵成)。下面来看看具体的代码示例：

构建比对参考基因组index
你可以自己准备好参考转录组文件来构建定量使用的index，或者你也可以省时省力去kallisto网站上下载已经构建好的index，目前准备好的index有人、小鼠、大鼠等具体见网站kallisto-transcriptome-indices。

#构建index
kallisto index -i gencode.vM24.transcripts gencode.vM24.transcripts.fa
# -i 指定生成的index文件的名字

bulk-RNAseq定量
构建好index后就可以来定量了，使用方法也是相当的简单，不过需要注意单双端测序的数据使用的命令不同，单端模式需要特定指定fragment的平均长度和标准差，而双端模式软件本身会自动评估这两个指标所以无需提供，具体代码如下：

#单端测序的定量
kallisto quant -i gencode.vM24.transcripts -t 5 --single -l 50 -s 1 -o . SRR9170683.fastq.gz
#双端测序的定量
kallisto quant gencode.vM24.transcripts -t 5 -o . SRR11600559_R1.fastq.gz SRR11600559_R2.fastq.gz

比对完成后会得到三个文件，以h5结尾的文件是定量结果的HDF5格式文件，可以使用kallisto的子命令h5dump将其转化为文本文件；以json为结尾的文件包含运行结果的摘要信息；以tsv结尾的文件是重要的定量文件。目录结构如下：

quant
├── abundance.h5 
├── abundance.tsv  
└── run_info.json

如果你想保留中间的比对结果如bam文件，可以在上面的定量命令中添加两个参数：--genomebam --gtf ${gtf_file}，这样定量完成后会在结果目录多生成一个bam文件。

scRNAseq的定量
kallisto支持很多单细胞测序技术如10X genomic(V1-V3)、CELSEQ(V1-V3)、DROPSEQ、INDROPS、SCRUBSEQ、SURECELL。你可以用如下的命令查看该软件支持的所有测序技术：

kallisto bus -l
List of supported single-cell technologies

short name       description
----------       -----------
10xv1            10x version 1 chemistry
10xv2            10x version 2 chemistry
10xv3            10x version 3 chemistry
CELSeq           CEL-Seq
CELSeq2          CEL-Seq version 2
DropSeq          DropSeq
inDropsv1        inDrops version 1 chemistry
inDropsv2        inDrops version 2 chemistry
inDropsv3        inDrops version 3 chemistry
SCRBSeq          SCRB-Seq
SureCell         SureCell for ddSEQ

用kallisto软件来定量单细胞数据使用的是bus命令，会生成BUS(Barcode,UMI,Set format)格式比对结果文件，然后借助bustools软件来生成定量文件。具体分为三个步骤，第一步是创建比对用的参考index，第二步是生成BUS文件，第三步定量。具体过程如下：

构建index
由于构建index过程与bulk-RNAseq一致，这里就不再重复展示了，代码同上方。
生成BUS文件
对于单细胞的数据定量前需要先把数据比对生成一个bus文件，具体代码如下：

#生成bus文件
kallisto bus -i gencode.vM24.transcripts -o SRR9169420_out -x 10xv2 SRR9169420_1.fastq.gz SRR9169420_2.fastq.gz

bus命令结束后会在结果目录生成四个文件，matrix.ec：表达量的矩阵等价类文件；output.bus：原始的BUS(Barcode,UMI,Set format)格式比对结果文件；run_info.json：比对结果的概要信息；transcripts.txt：定量生成的转录本文件；
目录结构如下：

SRR9169420_out
├── matrix.ec
├── output.bus
├── run_info.json
└── transcripts.txt

scRNAseq定量
bustools在对bus文件做定量的时候实际上包含了三个小的步骤分别为correct、sort、count，首先是对barcode的矫正，然后是排序，最后才是定量。不过bustools可以接受标准输入，所以可以将这三个小步骤可以用管道“|”连接起来，这样就可以直接从bus文件到生成定量结果一气呵成了，具体代码如下：

#一步从bus到定量结果
bustools correct -w 10xv2_whitelist.txt -p SRR9169420_out/output.bus | bustools sort -T bus_out/tmp/ -t 2 -p - | bustools count -o bus_out/genecount -g transcripts_to_genes.txt -e bus_out/matrix.ec -t bus_out/transcripts.txt --genecounts -

需要提醒的是在这里需要提供两个额外的文件：1、10xv2_whitelist.txt(10xv2试剂盒的barcode白名单文件，可以去10x官网下载，或者用bustools的whitelist命令从bus文件中生成一个)；2、transcripts_to_genes.txt(转录本到基因的对应关系文件)。定量完成后会生成一系列的结果文件，最重要的表达量文件是cells_x_genes.barcodes.txt、cells_x_genes.genes.txt、cells_x_genes.mtx(类似cellranger的结果)。

快捷方式

其实使用kallisto软件来做定量分析有一个更为快捷方便的方式可选，那就是使用软件kb_python来完成分析,该软件包装了kallisto和bustools两个软件，使用起来更为方便。就拿上面的scRNAseq定量来说，我们看看使用kb_python来分析有多方便，具体代码如下：

#安装kb软件
pip3 install kb-python
#使用kb软件来定量
kb count -i gencode.vM24.transcripts -g transcripts_to_genes.txt -x 10xv2 -o SRR9169420_out --filter bustools -t 5 SRR9169420_1.fastq.gz SRR9169420_2.fastq.gz

从上面的命令可以看出使用kb来做的定量可以省去中间的步骤，并且可以只给出试剂盒型号(这里是10xv2)而不提供barcode白名单文件。是不是省事省心，对于这么贴心的软件应该会心动了吧！