异体造血细胞移植（HCT）为血液恶性肿瘤和免疫疾病提供了有效的治疗方案，然而频繁的移植并发症限制了HCT后的长期获益。本研究发现循环游离DNA（cfDNA）是一种可用于监测HCT后主要并发症的多功能分析物，通过cfDNA重亚硫酸盐测序分析（cfDNA-WGBS）和疾病特异性生物信息学分析来揭示移植物抗宿主病（GVHD）、感染、移植失败和疾病复发等HCT并发症。结果表明cfDNA可以通过早期检测和预测HCT后的复杂并发症，从而改善异体HCT受者的护理。
标题：Cell-free DNA profiling informs all major complications of hematopoietic cell transplantation
期刊：Proc Natl Acad Sci U S A.
影响因子：IF 11.205
发表时间：2022.01.25
技术平台：cfDNA-WGBS，cfDNA宏基因组测序
研究摘要：
本研究论证了cfDNA作为监测HCT后受体的多功能生物标志物的效用，作者对27名异体HCT受者在手术前后预定时间点，从不同组织、微生物、供体细胞、肿瘤细胞等来源采集的170份血浆样本提取分离cfDNA进行全基因组甲基化分析，证明了仅需cfDNA全基因组甲基化测序分析这一种检测方法就可以同时监测HCT后出现的主要并发症。通过分析cfDNA甲基化标志物追踪cfDNA来源组织并量化组织特异性损伤来预测GVHD；通过cfDNA宏基因组测序分析来监测HCT术后感染；通过肿瘤特异性基因组畸变分析预测癌症复发；通过量化供体和受体特异性cfDNA比例预测癌症复发。分析结果发现HCT后1个月血液中供体实体器官的cfDNA甲基化分布可以预测急性GVHD；cfDNA的宏基因组分析揭示该患者群体的病毒再激活频繁发生；供体特异性cfDNA比例表明复发和缓解，而肿瘤特异性cfDNA比例则表明癌症复发。这项原理验证研究表明，cfDNA有可能通过早期检测和更好地预测HCT后发生的一系列复杂并发症来改善异体HCT受者的护理。
材料方法：
队列：
前瞻性队列研究，2018年8月至2019年8月期间从27名异体HCT接受者收集的170份血液样本。恶性血液病（n=25）VS非恶性血液病（n=2）
时间点：
血浆采集的标准时间点在患者招募前确定，包括预处理（第一次预处理剂量的当天，在接受治疗之前）、移植前（移植的当天，造血细胞输注前）、移植和移植后的第1、2、3、 6个月。在出现BK病毒相关症状、疾病或再激活的并发症情况下，收集额外样本。
图1
研究结果
HCT手术前后宿主的cfDNA动力学
作者从采集的血浆中分离出cfDNA（每个样品0.5~1.9 mL）进行全基因组重亚硫酸盐测序和生物信息学分析，以分析cfDNA中可能提示HCT后并发症的表观遗传和遗传标志物。作者首先通过甲基化分析鉴定cfDNA来源组织的作用，以评估临床诊断GVHD前获得的血浆样本HCT后GVHD引起的器官损伤。为量化不同血管化组织和血液细胞的cfDNA相对比例，作者分析了cfDNA甲基化谱及细胞和组织的参考甲基化谱（测序深度大于0.1×，138个参考组织样品）。
图2：Host-derived cfDNA dynamics before and after HCT
甲基化分析cfDNA来源组织监测GVHD
接下来，作者通过评估cfDNA来源组织的性能来预测GVHD。将GVHD定义为HCT后6个月内疾病任何阶段的临床表现（GVHD+），发现实体器官的cfDNA浓度比总cfDNA浓度更能揭示GVHD，突出了甲基化分析对GVHD检测的重要性。此外研究还发现，与皮肤GVHD阴性（GVHD-）样本相比，GVHD患者（GVHD+）的血浆样本在临床诊断皮肤GVHD之前具有更高的皮肤源性cfDNA负荷。在发生严重（3级或4级）皮肤GVHD的患者中，皮肤源性cfDNA浓度最高。这些结果表明了WGBS在鉴定GVHD发病部位方面的前景。
cfDNA浓度计算公式
HCT后血浆病毒组筛查
通过cfDNA宏基因组测序可以在循环中检测到来自微生物的cfDNA，这为筛查HCT后感染提供了一种特别有效的方法。此前研究已证实通过WGBS进行cfDNA宏基因组测序的可能性。因此，本研究作者挖掘了微生物来源的所有cfDNA数据，首先鉴定并删除与宿主相关的序列，并将剩余的未比对reads与一组微生物参考基因组进行比对。通过背景校正算法以消除校准噪声和环境污染造成的影响，并通过物种reads的相对丰度与人类reads的相对丰度来比较物种丰度（相对基因组当量[RGE]）。
分析结果发现HCT后DNA病毒cfDNA负荷显著增加，其中大多数不是系统临床测试的一部分，Anelloviridae物种的病毒最为富集（463次）。与发现结果一致，DNA病毒的cfDNA负荷增加主要是由于HCT后几个月Anelloviridae的负荷增加（图3A）。并在26名患者（总27）的100份血样（总170）中鉴定出Herpesviridae 和 Polyomaviridaec病毒cfDNA。此外通过cfDNA检测到BK多瘤病毒。以上结果证实了通过cfDNA高敏筛查HCT后感染性并发症的可能性。
图3：Infectome screening in HCT patients.
肿瘤和供体特异性 cfDNA 提示癌症复发和移植失败
许多研究证实循环肿瘤特异性cfDNA在早期癌症检测和微小残留病监测中的作用。本研究评估了癌症相关CNA的cfDNA分析检测血浆中白血病来源DNA的作用。结果发现全基因组cfDNA分析能够检测 RHP（Rapid Heme Panel）中未包含区域中的 CNA，表明了全基因组方法的重要性。在患者的单个样本中检测到拷贝数变化，而该患者在其预处理时间点前100 天的RHP中未检测到变化。cfDNA来源组织分析显示，除了肿瘤来源的cfDNA负荷增加外，实体器官来源的cfDNA负荷也增加，可能指向联合 GVHD 和复发。
图4：tumor fraction estimation using CNAs
血浆供体来源的cfDNA作为混合嵌合体标志物
最后，作者利用性别不匹配受体中X染色体和Y染色体的相对丰度来检测供体来源cfDNA（dd cfDNA）的可行性，结果证明了dd-cfDNA是HCT监测的生物标志物，可与其他cfDNA特征结合使用。
图5：Donor fractions and days posttransplant in sex-mismatched patients
前沿技术：cfDNA甲基化技术推荐
对于cfDNA等相对微量且片段化十分严重的样本，常用甲基化检测主要包括cfMeDIP，微量WGBS技术。应用RRBS检测的CG位点极为有限，主要原因cfDNA自身就在选择片段范围之内，如果片段内CG含量高被酶切，反而更短不被富集，因此可能检测到的都是CG含量低的区域片段。
为助力低样本量多维度分析，易基因开发了富集覆盖CpG岛、启动子、增强子、CTCF结合位点的cfDNA甲基化测序方法——cfDNA-RBS，实现了高灵敏度和样本复用，使其具有高度可扩展性，并适用于有限的样本和单个细胞。
易基因建立的cfDNA-RBS技术，仅需10-15G测序数据，DNA建库起始量低至5ng的cfDNA样本，可以检测到的5X位点高达4M以上，是目前肿瘤甲基化标志物检测研究的优选技术，应用场景包括肿瘤早筛、肿瘤诊断、个性化用药、实时监控、预后监测等。
癌前病变的癌变预警标志物检测
肿瘤早期筛查标志物检测
肿瘤预后标志物检测
药物疗效预测标志物检测
WGBS、cfDNA-RBS、RRBS技术位点覆盖对比
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