1、将参考基因组进行重亚硫酸盐的预处理转换

bismark_genome_preparation --verbose --bowtie2  ~/WGBS/ref/

结果：

形成Bisulfite_Genome目录
Bisulfite_Genome目录下的两个目录

2、将数据比对到已经转化了的参考基因组上

一次处理单个样本：

bismark -p 8 --genome ~/WGBS/ref -1 ~/WGBS/2_CleanData/control/control_P_R1.clean.fq -2 ~/WGBS/2_CleanData/control/control_P_R2.clean.fq -o ~/WGBS/map

一次处理多个样本：

bismark -p 8 --genome ~/WGBS/ref -1 ~/WGBS/2_CleanData/control/control_P_R1.clean.fq -2 ~/WGBS/2_CleanData/control/control_P_R2.clean.fq -o ~/WGBS/map;bismark -p 8 --genome ~/WGBS/ref -1 ~/WGBS/2_CleanData/insulin/insulin_P_R1.clean.fq -2 ~/WGBS/2_CleanData/insulin/insulin_P_R2.clean.fq -o ~/WGBS/map;bismark -p 8 --genome ~/WGBS/ref -1 ~/WGBS/2_CleanData/Insulin_hcg/Insulin_hcg_P_R1.clean.fq -2 ~/WGBS/2_CleanData/Insulin_hcg/Insulin_hcg_P_R2.clean.fq -o ~/WGBS/map

ps:--genome /路径/ref ref目录下要有Bisulfite_Genome目录和GRCm38.p6.genome.fa文件；-p 8 线程数，将整个任务分成若干小块同时处理，可以提高运行效率
用分号（；）分割命令，可以一次处理完所有要比对的序列
结果：

形成.bam和report.txt文件

3、将bismark比对生成的bam文件进行排序和索引（排序和索引去重复后进行）
排序(排序的目的是为了下游分析的方便)

for i in control_P_R1 Insulin_hcg_P_R1 insulin_P_R1;do samtools sort $i.clean_bismark_bt2_pe.bam -o $i.clean_bismark_bt2_pe.sorted.bam

对排序后的文件进行索引(生成.bai文件)

for i in control_P_R1 Insulin_hcg_P_R1 insulin_P_R1;do samtools index $i.clean_bismark_bt2_pe.sorted.bam;done 

结果：

排序和索引后的结果

一条命令完成排序和索引：

for i in control_P_R1 Insulin_hcg_P_R1 insulin_P_R1;do samtools sort $i.clean_bismark_bt2_pe.bam -o $i.clean_bismark_bt2_pe.sorted.GG.bam;samtools index $i.clean_bismark_bt2_pe.sorted.GG.bam;done