Cluster Analysis

clp

07 June, 2020

寻找差异表达特征(cluster biomarkers)

Seurat可以帮助您通过差异表达找到定义clusters的标记(markers)。默认情况下，相对于所有其他细胞，它识别单个簇(在ident.1中指定)的正负标记。FindAllMarkers为所有clusters自动执行此过程，但您也可以对clusters组进行相互测试，或针对所有细胞进行测试。

min.pct 参数要求在两组细胞中的任一组中以最小百分比检测到特征，而thresh.test参数要求在两组细胞之间以一定数量(平均)差异表示特征。您可以将这两个值都设置为0，但会大大增加时间-因为这将测试大量不太可能具有高度特异性(有生物学意义)的特性。作为加速这些计算的另一个选项，可以设置max.cells.per.ident。这将对每个标识类进行下游采样，使其细胞数不超过设置的值。虽然通常会失去效力，但速度的提高可能会很显著，最具差异性的特征值可能仍然会上升到顶端。

加载前面获取的数据和必要的R包

library(Seurat)
library(ggplot2)
library(data.table)

if (!('pbmc' %in% ls())) {
    load("filtered_gene_bc_matrices/hg19/02_pbmc3k_cluster.rd")
}
#check which assay set to default!
DefaultAssay(pbmc)
#> [1] "SCT"

让我们将一个簇与其余簇进行比较，以便与其他簇相比，哪些基因表达较高，哪些基因表达较低。

# find markers for every cluster compared to all remaining cells, report both positives and negatives. The output DGE table is converted to data.table for better handling,
pbmc.markers <- as.data.table(FindAllMarkers(pbmc, only.pos = TRUE, min.pct = 0.25, logfc.threshold = 0.25))
pbmc.markers <- pbmc.markers[!is.na(gene),]

# We collect top 10 distinct genes for each cluster
top10 <- pbmc.markers[,.SD[order(-avg_logFC)][1:10],by='cluster']
top10 <- top10[!is.na(gene),]

View(top10)

Slots vs. DGE method

在归一化步骤中，SCTransform在有3个可用slot的地方创建SCT分析。FindAllMarkers选项中有多个dge方法。根据哪种DGE方法，我们必须提供适当的slot。

Task: Explore the function, FindAllMarkers to see what the function is and which options are available!

#?FindAllMarkers()

查找数据集中每个标识类的标记(差异表达的基因)

可视化基因表达水平

我们包括几个用于可视化标记表达式的工具。VlnPlot(展示跨clusters的表达概率分布)和FeaturePlot(在tSNE或PCA图上可视化特征值表达)是我们最常用的可视化方式。我们还建议使用RidgePlot, CellScatter和DotPlot作为查看数据集的其它方法。

# Note that the default slot is 'data' (log normalized)
Idents(pbmc) <- "seurat_clusters"
goi1 <- c("CD8A", "GZMK", "CCL5", "S100A4", "ANXA1", "CCR7", "ISG15", "CD3D")
VlnPlot(pbmc, features = goi1, ncol=4)

image.png

# Gene expression on UMAP
goi2 <- sort(c("MS4A1", "GNLY", "CD3E", "CD14", "FCER1A", "FCGR3A", "LYZ", "PPBP", "CD8A"))
FeaturePlot(pbmc, features = goi2)

image.png

# Use ROC model for DGE testing,
pbmc.markers.roc <- as.data.table(FindAllMarkers(pbmc, only.pos = TRUE, test.use='roc', min.pct = 0.25, logfc.threshold = 0.25))
pbmc.markers.roc <- pbmc.markers.roc[!is.na(gene),]

top1 <- pbmc.markers.roc[,.SD[order(-myAUC)][1],by='cluster']
FeaturePlot(pbmc, features = sort(top1$gene))

image.png

DoHeatmap为给定的细胞和features表达生成热图。在本例中，我们绘制每个cluster的前10个标记(如果少于20个，则绘制所有标记)。

DoHeatmap(pbmc, features = top10$gene) + NoLegend()

image.png

Save DGE table.

save(pbmc.markers,top10,top1,file='filtered_gene_bc_matrices/hg19/03_pbmc3k_clusterAnalysis.rd',compress=TRUE)

本节重点

• Differential gene expression analysis to describe clusters
• To choose an appropriate matrix upon DGE method
• data.table