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研究概述：
肝细胞癌（HCC）是全球癌症相关死亡的第三大常见原因。大多数肝癌发展为肝纤维化或肝硬化。基质刚度是微环境中生物物理信号的特征，异常基质僵硬在肿瘤进展过程中起着重要作用，是肝细胞癌发病率的强大预测因素。作者研究了脂质代谢重编程对基质刚度引发的肝癌进展的具体影响。长链酰基-CoA脱氢酶（ACADL）是一种线粒体酶，可催化脂肪酸氧化的初始步骤，ACADL是一种重要的机械介质，可以重新编程HCC细胞脂质代谢。作者发现，ACADL依赖性机械反应通路对不断增加的基质刚度（肿瘤微环境中的生物力学信号）做出反应，并通过脂质代谢重新编程促进HCC进展，为HCC治疗提供了新的治疗目标。
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研究结果：
BULK转录组分析揭示了HCC中明显的代谢失调
作者估计了癌症基因组图集（TCGA）队列中每个样本中74个代谢途径的丰富评分。根据74个代谢途径的丰富评分，所有374个HCC肿瘤被归类为三种异质亚型，分成3组（图1A-E）。
2.集群1特征是聚糖代谢途径的相对上调，与细胞外基质（ECM）的产生有关，但三种主要营养素（碳水化合物、脂质和氨基酸）的代谢途径受到下调。集群3特征是脂质、氨基酸和碳水化合物代谢途径的显著上调。集群2的特征是每个主要类别的合并失调。
3.肿瘤纯度没有显著差异。主成分分析（PCA）揭示了存在三个不同的转录组簇（图1D），表现出不同的临床特征。此外，集群1的总体生存率（OS）（p < 0.01）和无病生存率（DFS）明显低于集群3（图1F-G）。第1组中wnt β-catenin信号传导、TGF-β信号传导和PI3K/Akt mTOR信号显著上调，这暗示各种与癌症相关的通路被激活。作者发现ECM受体相关途径显著富集，在第1组中脂肪酸代谢途径下调。脂肪酸代谢的下调与肿瘤的侵袭性相关。
基于代谢途径的集群表现出独特的基因组和转录组学特征
以比较集群1和集群3样本中的基因表达（图2A）。对每个差异表达的基因组进行了KEGG和REACTOME分析，发现有丝分裂细胞周期检查点、细胞周期阶段和细胞外基质组织的途径在集群1中相对丰富，与物质代谢过程相关的基因集被发现在集群3中富集（图2B）。在圆环图中使用KEGG分析获得了类似的结果。与肿瘤发生和发育相关的类别在集群1中得到了丰富（图2C），第3组中富集了与脂质相关的代谢途径（图2D）。进一步分析表明，与第1组相比，第3组脂肪酸和胆汁酸相关的代谢途径明显上调，而第1组相比，第3组中包括“焦点粘附”、“细胞粘附分子”、“ECM-受体相互作用”和“Hippo信号通路”的通路显著上调（图2E，F）。
作者进一步分析了突变频率最高的前20个基因（图2G，H），发现CTNNB1、TP53在集群1和集群3组中的突变频率存在显著差异。
与癌症相关成纤维细胞（CAF）和脂肪酸降解相关的途径之间的相关性
1.通路分析表明，这些代谢途径富含氨基酸和脂质代谢，特别是脂肪酸降解，也称为“脂肪酸氧化（FAO）”（hsa00071）（图3A）。分析脂肪酸降解途径中所有基因的表达水平，发现这些基因在集群3中富集，与其他亚群相比，大多数基因在集群3中表现出明显更高的mRNA水平（图3B）。生存分析显示，与低评分的患者相比，FAO通路得分较高的患者具有更好的DFS和OS（图3C、D），表明FAO通路激活可能会抑制HCC的发生和发育。
2.作者研究了微环境中不同细胞亚群的转录模式，并发现集群1和集群3之间存在显著差异。（图3E-F）与第3组的患者相比，第1组T细胞谱系、细胞毒性淋巴细胞、NK细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、骨髓细胞和癌症相关成纤维细胞（CAF）的丰度显著较高，特别是CAF。同样，第1组的患者表达了高水平的CAF标志物（图3G）。此外，CAF评分的程度与FAO评分呈负相关（图3H）。FAO与成纤维细胞迁移、胶原蛋白激活信号通路、胶原蛋白形成、胶原蛋白受体活性和胶原蛋白生物合成过程表现出显著的负相关性（图3H）。脂肪酸降解的生物过程可能与CAF的功能有关。
基于scRNA-seq数据的肿瘤微环境中恶性细胞和其他细胞的代谢途径亚型
作者使用肝癌单细胞数据，鉴定出七种主要细胞类型，包括T细胞、恶性细胞、未分类细胞、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、B细胞、肿瘤相关内皮细胞（TECs）和CAFs（图4A）。分析显示，恶性细胞和TAM以及CAF之间受体-配体对的相互作用明显增加，这表明这两个集群之间的细胞通信密切。
可视化单个细胞的代谢多样性，发现脂肪酸降解途径主要在恶性细胞中富集，而ECM蛋白聚糖途径在CAF中富集（图4B、C）。
根据相同的聚类方法，所有患者都被稳定地分配到三种代谢亚型（图4D，E），第3组的脂肪酸降解评分明显上调，而第1组的O-聚糖代谢上调。每种细胞类型的比例因集群而异（图4D）。进一步分析表明，与第1组相比，第3组的脂肪酸降解评分显著上调。胶原蛋白相关途径在CAF和集群1中显著丰富，集群3中恶性细胞和脂质代谢途径显著丰富（图4F，G）。上述途径水平在CAF和恶性细胞之间显示出很强的负相关性（图4H）.
ACADL作为脂肪代谢的关键酶在HCC中受到下调
作者总结了在集群3中高度表达的十大途径的关键酶（表1）。单变量Cox回归分析显示，只有FAO相关基因（ACADL）保持显著的预后意义（图5A）。ACADL是FAO线粒体第一步的关键酶，与正常肝脏相比，在肝癌组织中中减少（图5B）。ACADL与各种CAF和胶原蛋白相关基因呈负相关（图5C），各种肿瘤的ACADL显著降低（图5D）。与ACADL表达率高的HCC患者相比，ACADL表达率低的HCC患者的总体生存率和无疾病生存率较低（图5E、F）。
进一步分析表明，在较高的HCC临床阶段，ACADL表达逐渐下降。HCC患者被分为两组，肝基质较硬的患者ACADL表达较低（图5G）。在外部验证队列中观察到类似的结果（图5H-J）。作者猜想，基质硬度可能会通过调节ACADL表达来影响脂质代谢的重新编程。
基质刚度通过YAP-TEAD4-ACADL调节调节脂质代谢重新编程
1.为了验证假设，使用HepG2、Huh7和SK-Hep1 HCC细胞进行测试，微刚度分别为2 kPa和16 kPa。HCC细胞在16 kPa的支撑上呈现侵入性表型，显示具有典型HCC细胞形态的多边形细胞的突出外观，而2 kPa以下细胞是球形的，以小点出现（图6A）。16 kPa高基质刚度的肝癌细胞增加了介质中的游离脂肪酸水平，mRNA和ACADL的蛋白质水平明显下调（图6B-D）。在高刚度基质中观察到活性YAP/TAZ的上调蛋白水平（图6D）。
2.Verteporfin是一种YAP抑制剂，可以破坏YAP-TEAD的相互作用。当用增加的Verteporfin浓度进行治疗时，HCC细胞表现出明显较低的脂质积累水平，这表明破坏YAP-TEAD相互作用可以帮助利用HCC中的脂质（图6E）。随着verteporfin浓度的增加，HCC细胞中的ACADL mRNA和蛋白质水平增加（图6F，G）。此外，YAP下游基因CYR61在Verteporfin治疗浓度的增加下逐渐降低（图6H）。ACADL的mRNA和蛋白质水平在YAP5SA过度表达HepG2和Huh7细胞中都出现下调（图6I，J）。细胞质/核蛋白提取分析表明，YAP在软支撑上的细胞中的核积累较少（图6K）。这些结果表明，ACADL表达在转录水平上受到YAP的负面调节。
3.作者识别了人类ACADL基因启动子区域的三个保守的TEAD4结合位点（AGCATTCTTT）（图6L）。染色质免疫沉淀（ChIP）PCR结果表明，TEAD4可能会与ACADL启动子远端保守位点（R3）结合（图6M）。作者生成了两个由野生型（WT）和TEAD4结合缺陷ACADL启动子驱动的荧光素酶记录器（图6K）。siRNA介导的YAP/TAZ击倒显著增强了HepG2和Huh7细胞中WT ACADL启动子R3的转录活性，但对突变ACADL启动子没有影响（图6N）。
软基质增加体内ACADL的mRNA和蛋白水平
动物实验流程如图7A所示。β-氨基丙烯腈（BAPN）是一种LOX活性抑制剂。和对照组相比，BAPN组的肿瘤体积明显较小，较轻（图7B-D），胶原蛋白含量显著下降（图7E），ACADL肿瘤组织中的mRNA和蛋白质水平变高，ACADL的表达显著增加，CAF标记基因YAP和α-SMA的表达显著增加（图7F）。
胶原蛋白含量的增加和ACADL下调协同预测了肝癌患者的不良预后
免疫荧光表明，I型胶原蛋白染色特异性地存在于肿瘤的基质中，而ACADL优先分布在细胞质中，胶原蛋白含量与HCC中的ACADL表达水平呈显著负相关（图8A，B）。与顺应性肿瘤患者相比，硬性肿瘤患者的OS较差（图8C）。低ACADL表达的患者比高ACADL表达的患者预后更差（图8D）。
HCC患者预后根据ACADL表达水平和胶原蛋白含量分层，胶原蛋白低/ACADL高肿瘤患者相比，高胶原蛋白/ACADLlow肿瘤患者的生存结果明显较差（图8E）。在TCGA-LIHC队列中，高胶原蛋白/ACADLlow的肿瘤与生存率低下有关（图8F）。本研究表明ACADL依赖性机械反应通路是HCC治疗的潜在治疗目标（图8G）
研究总结：本研究中，作者证明，肝癌患者根据其代谢特征具有独特的转录组特征，这表明针对代谢脆弱性的不同治疗策略可能对肝癌患者的亚群具有临床优势。此外，这项研究还将基质刚度-ACADL轴与脂质代谢重编程和HCC进展联系起来，表明ACADL依赖性机械反应通路是HCC治疗的潜在治疗目标。
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