Sanofi 公司 2019年11月在《nature cancer》 发表文章 《三特异性抗体通过共激活T细胞受体提升定向肿瘤细胞治疗的效率 》，重新推出了 CD28 这个T细胞共激活靶点，是一篇经典的学习文章。
摘要
尽管治疗方法有了重大的进步，如免疫检查点和CAR-T等治疗方法，许多恶性肿瘤仍然对免疫治疗没有反应。同时靶向肿瘤抗原和激活T细胞受体信号通路的双特异性抗体显示出一定的临床效果；然而，如果提供共激活信号也许可以提升T细胞抗肿瘤的反应。这里，文章开发了一种三特异性抗体它可以靶向CD38，CD3和CD28 靶点，增强 T 细胞激活和靶向肿瘤。同时连接 CD3 和 CD28 可以提升T 细胞的激活效率，靶向抗CD38 的结构域可以指引 T 细胞靶向骨髓瘤细胞，治疗淋巴瘤和白血病。在人源化的小鼠模型中，该抗体可以抑制骨髓瘤细胞的生长，同时激活记忆/效应T细胞分化，减少非人类灵长动物中的调节性 T 细胞，并且耐受剂量不错。总之，三体异性抗体代表肿瘤免疫治疗的一种有前景的平台。
引言
T细胞连接子是一种有效的免疫治疗的方法，它可以激活T 细胞同时靶向特定的恶性肿瘤细胞。尽管双特异性抗体已经有成功的案例，但是同时靶向更多的位点可以提升位点的特异性和信号转导能力，维持T 细胞的持续反应。文章这里开发的多特异性抗体可以提升T 细胞激活的效价，识别多种骨髓瘤细胞，提升裂解效率，抑制肿瘤的生长。
结果
双特异性抗体和三特异性抗体对 T 细胞激活和存活的优化
1、T 细胞活化发挥功能和维持增殖需要 两个信号。T 细胞受体 CD3 复合物激活可以诱导转录激活并引起细胞因子释放；与第二个膜蛋白 CD28 结合，可以激活第二个信号转导通路，抑制细胞的程序性死亡。只通过激活CD3，缺乏第二信号时会导致激活的细胞死亡。
2、文章假定 T 细胞的分化可以通过结合两个特性的不同靶点实现。使用 α-CD3ε 当做第一信号，使用 α-CD28 当做第二信号，评估 cross-over-dual variable(CODV) 形式的双抗是否能激活 T 细胞，并维持 T 细胞持续激活的状态。文章选择了中等亲和力（Kd=~20nM）的 anti-CD3ε 抗体来避免大量的细胞因子释放和细胞因子风暴。这个CD3激动剂与超级激动剂CD28一起，交换相互位置，测试激活作用。在体外，CODV 与人 PBMCs 一起孵育，测定 IFN-γ 和 IL-2 作为 T 细胞激活的指标。CD3位于近端，CD28位于远端时激活效果更好，该 CODV 形式与 anti-CD38 抗体一起组成三特异性抗体形式。如 Fig1a 所示
3、 使用稳定表达三种抗原的 Jurkat 细胞 验证 CD38/CD3×CD28 三抗的T细胞激活效果。每个结构域的激活效果可以通过结合位点单点突变敲除进行测试，最终结果显示这三个结构域对激活都起作用。T细胞激活的作用排名为 : CD3 > CD28 > CD38。如图Fig1b 所示
4、之前有研究表明CD28 信号可以通过 抗凋亡蛋白 Bcl-xL 促进前T细胞的存活。使用野生型和突变型的三抗与前T细胞一起孵育，检测CD4和CD8细胞 Bcl-xL 的表达。CD38/CD3、CD38/CD28 和 三抗阴性对照都没有激活表达。而且，CD28的激活需要CD3参与前T细胞的激活。如图Fig1c、Fig1d所示
5、Bcl-xL诱导动力学和 Annexin V凋亡实验 共同显示 CD28 在 CD3 激活的情况下，可以促进 T 细胞的生长。如图 Extended Data Fig1
IgG4型Fc 受体结合位点的修改减少非特异性的炎症
1、抗体的Fc 段可以和单核、NK细胞表面的 receptor 结合，诱导非特异性的炎症，导致细胞因子释放综合症。因此，文章选用 IgG4 类型 进行抗体组装。之前有文献报道 FALA 突变可以消除 Fc 与 Fc receptor 的结合，如图Extended Data Fig2
2、为了验证是否有非特异性的细胞因子释放，测试了在不含有/含有 RPMI 8226 骨髓瘤细胞系时，IFN-γ 的释放情况。结果显示在没有激活时，含有FALA突变的IgG4废止了IFN-γ的释放，在含有CD38 TAA时能增强IFN-γ的释放。如图Fig2ab
α-CD38 和 α-CD28 对溶解活性的贡献
1、选择CD38和CD28高表达细胞系（RPMI 8226）和低表达细胞系（KMS-11）进行溶解活性测定。CD3区域突变之后，溶解效应废除。CD38和CD28没有突变时，虽然溶解作用急剧减少，但仍保留部分功能。说明 CD38和CD28 对肿瘤细胞杀伤都有贡献。如图Fig2c
2、对比 α-CD38 单抗 daratumumab，该三抗的杀伤在要比其高3-4个log数量级。如图Fig2d
CD38/CD3+CD28 抗体激活中心记忆CD4和CD8，Th1 和 抗原特异性反应
1、为了测试 CD38/CD3×CD28 三抗是否增强了细胞免疫，文章评估了 T 细胞激活的类型。在缺乏细胞因子的情况下，三抗和突变对照抗体与PBMCs孵育7天。
2、CD4 亚群分化最多，TH1 的数量要远高于TH2和TH17。CD8 亚群在7天内有150倍的增长。如图Fig3所示
3、综上数据所示，三抗可以激活TH1功能和保护性 CD8 记忆T细胞，增强细胞免疫
位于多发型骨髓瘤细胞上的CD28 可增强 T 细胞识别和溶解
1、大部分多发性骨髓瘤细胞系上都表达 CD28 糖蛋白，它增加了骨髓瘤的进展和预后不良的几率。为了验证目标细胞上CD28的表达是否提升 T 细胞的识别和溶解，文章比较了不同细胞系上野生型、三抗和无CD28三抗的溶解表现。在三个细胞系上，CD28突变之后，其溶解效率减少了30-100倍。如表sTable1 和 Fig4a 所示
2、使用 CRISPR 介导的基因敲除方法去除骨髓瘤细胞中的CD28，称为CD28KO。用CD28KO和野生型细胞系对比确认肿瘤细胞上 CD28 对肿瘤识别和溶解的影响。CD28KO细胞系的溶解与野生型相比降低了10-100倍。在CD28KO细胞系上，含有CD28突变和不含CD28突变的三抗差别不大。如图Fig4b所示
相对CD3和CD28 对细胞因子释放的影响
1、之前 TeGenero 公司开展过一项针对超级激动剂 anti-CD28 单抗的临床试验（100ug/kg），造成了非常严重的毒副作用，主要的原因是细胞因子风暴。后续 TeGenero 公司使用更低剂量（初始为10ng/kg，最终为 7ug/kg）后续没有安全问题报道
2、文章使用 TeGenero 抗体TGN（二价）、TGN sIgG（单价）、CD28sIgG 来观测细胞因子的释放。文章也检测了三抗中各个区域敲除之后对细胞因子释放的影响。当CD3区域敲除后消除了细胞因子的释放，然而CD28区域敲除之后细胞因子释放效果轻微减少。结果显示三抗的毒性主要来源于CD3二不是CD28超级激动剂，而且超级激动剂的毒性可以通过梯度增加剂量减弱。如图Fig5ab所示
CD38三抗的晶体结构
1、CODV 臂 (α-CD28/α-CD3) 和 α-CD38 Fab 的结构，如图 Extended Data Fig3ab 所示
2、anti-CD38/CD3×CD28 三抗结构如图 Fig6a 所示（ID:5DK3）
3、在细胞膜性CD28呈二聚体的形式，CD28 与三抗结合的示意图如Fig6b所示
在非人类灵长动物（NHPs）中药物动力学、毒性和免疫激活
1、肿瘤免疫疗法也伴随着细胞因子释放的毒性。由于三个的结合位点都与猴子同源，因此在 NHPs 中评估了三抗的药物动力学、毒性和免疫激活效果。在单一剂量实验中，文章发现在猴子上最大耐受剂量 MTD 与给药方式相关，静脉注射的MTD在30-75 ug/kg之间，皮下注射的MTD大于100ug/kg，如表sTable3。这种差异可能与静脉注射的高血清抗体浓度相关，静脉注射的浓度峰值为120ng/ml，而皮下注射的浓度峰值为20ng/ml。如图Fig7a所示
2、两种给药方式，T细胞、B细胞、NK 和单核细胞都会有暂时的下降，并在96h后恢复正常，如图Extended Data Fig4a 所示。两种给药方式CD4和CD8与三抗的结合与时间的关系如Fig7b所示
3、可以使用 intra-subject剂量递增 方法减少细胞因子释放的毒性。当以10,30,50,100 这样逐渐给药时，NHPs 可耐受的剂量达到了100ug/kg，而单一给药该剂量不可耐受，如表sTable3所示。
4、CD38三抗在 NHPs 上显示出可以接受的药代动力学和毒性。有效性数据只有在临床试验中才能得到，但是动物实验显示在耐受剂量下可以进行有效的免疫激活，很有可能安全地应用于临床。
示差显微镜在体外观测肿瘤的溶解、在体内观测CD28的保护作用
1、示差显微镜显示对照抗体和三抗在 PBMCs 和 RPMI 8226 细胞系存在条件下，对肿瘤细胞的裂解，如图Fig8a所示
2、为了验证CD38三抗在体内抑制肿瘤的效果，使用人源化 NSG 重建小鼠进行测试。在三抗存在条件下肿瘤生长显著被抑制，有效剂量低至1ug/kg。如图Fig8b所示
3、为了验证 anti-CD28 在体内的有效性，三抗和CD28突变的三抗在1ug/kg剂量下进行相同的动物实验。WT 三抗有明显的抗肿瘤效果，CD28突变的三抗和对照抗体结果差异不大，说明anti-CD28臂有助于三抗抗肿瘤作用。如图Fig8c所示
讨论
下一代T细胞免疫多重特异性抗体
1、CD38 是一种多功能的胞外酶表达在淋巴系细胞表面，包括 T、B和NK细胞表面，它也在许多血液恶性肿瘤中高表达包括多发性骨髓瘤、急性髓质白血病、慢性淋巴细胞白血病。CD38作为骨髓瘤的热门靶点，它不仅在肿瘤细胞中高表达，而且具有免疫调节作用。耗竭的T细胞表面和HIV-1感染的T细胞表面，CD38都会上调。CD38/CD3×CD28 三抗可以激活T细胞并产生记忆细胞，并且可以提升免疫能力，对那些即使不表达 CD38 或 CD28的肿瘤都有作用。
2、anti-CD3ε 激动剂抗体可以引起 T 细胞激活并释放细胞因子，但是这类抗体也有一些限制因素。第一，高亲和力的抗体会激活高水平的细胞因子释放，导致细胞因子风暴，这也是 CAR-T 和 T 细胞连接子的负反应；第二，CD3 激活是 T 细胞分化的两个信号之一，但是只激活这一个信号会导致激活的细胞死亡，限制了长久的抗肿瘤反应。文章开发的三抗靶向 CD28 靶点，可以促进激活T细胞的存活。
参考文献
[1] Wu L, Seung E, Xu L, Rao E, Lord DM, Wei RR, Cortez-Retamozo V, Ospina B, Posternak V, Ulinski G, Piepenhagen P, Francesconi E, El-Murr N, Beil C, Kirby P, Li A, Fretland J, Vicente R, Deng G, Dabdoubi T, Cameron B, Bertrand T, Ferrari P, Pouzieux S, Lemoine C, Prades C, Park A, Qiu H, Song Z, Zhang B, Sun F, Chiron M, Rao S, Radošević K, Yang ZY, Nabel GJ. Trispecific antibodies enhance the therapeutic efficacy of tumor-directed T cells through T cell receptor co-stimulation. Nat Cancer. 2020 Jan;1(1):86-98. doi: 10.1038/s43018-019-0004-z. Epub 2019 Nov 18. PMID: 35121834.
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