2019-01-13

1.个人对CRISPR-Cas9筛选的理解：
CRISPR-Cas9筛选：使用阴性筛选，阳性筛选和对照筛选，以文章中使用全基因组gRNA文库筛选使黑色素瘤对细胞毒性T细胞介导的杀伤具有抗性的基因为例。用具有对内源性鼠科抗体相对低TCR亲和力的Pmel-1 T细胞作为阴性筛选，高亲和力的OT-I T细胞作为阳性筛选，不相关特异性T细胞作为对照组。CRISPR-Cas9编辑之后的细胞系与T细胞（Pmel-1 T细胞，OT-I T细胞和不相关特异性T细胞）共培养。

阳性筛选：若CRISPR-Cas9编辑敲除了使肿瘤对T细胞介导的细胞毒性敏感的基因（简称敏感性基因），则与T细胞共培养的肿瘤细胞就不会被杀死，提取去除T细胞后再生细胞的基因组DNA，对具有代表性的gRNA进行Illumina测序，阳性筛选中测序得到的gRNA与对照组相比，剩余的gRNA（富集gRNA）使用 MaGeCK等生物信息学软件分析可以找到与gRNA对应的基因。该基因即为被CRISPR-Cas9编辑敲除掉的基因，且该基因使肿瘤细胞对T细胞介导的细胞毒性杀伤敏感，其被敲掉后使肿瘤细胞对T细胞介导的细胞毒性杀伤具有抗性而存活了下来。

阴性筛选：若CRISPR-Cas9编辑敲除了使肿瘤对细胞毒性T细胞介导的杀伤具有抗性的基因（简称抗性基因），则肿瘤细胞与T细胞共培养后，由于抗性基因被敲除而能够被细胞毒性T细胞杀死，去除T细胞再生的细胞的gRNA经Illumina测序后与对照组细胞相比，缺少的gRNA即为所筛选的gRNA（消耗gRNA）,测序得到的gRNA并非目的gRNA，因为测序得到的gRNA为去除细胞毒性T细胞后再生细胞（对细胞毒性T细胞具有抗性的肿瘤细胞）的gRNA。同样通过 MaGeCK等生物信息学软件分析可以找到与gRNA对应的基因，该基因使肿瘤细胞对细胞毒性T细胞介导的杀死具有抗性。

参考材料：李欢欢, 黄承浩. 基于CRISPR-Cas9的功能基因筛选研究进展[J]. 生物工程学报, 2018, 34(4): 461-472.

2.慢病毒包装的学习笔记：

慢病毒包装为什么要用这么多个质粒？因为需要携带有荧光标记的目的基因的质粒及包装质粒，包装质粒提供编码病毒外壳的质粒，编码包膜蛋白的质粒，和编码聚合酶的质粒。

慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。

3.文献： Pan D , Kobayashi A , Jiang P , et al. A major chromatin regulator determines resistance of tumor cells to T cell–mediated killing[J].Science, 2018:eaao1710.

下面是我自己简要概括该文章的大概思路

思路：使用CRISPR-Cas9筛选出基因，pathway分析基因所属于的通路，分析得到很多使肿瘤细胞中对细胞毒性T细胞介导的杀伤具有抗性基因和通路。选择其中的一条通路（PBAF复合物）在黑色素瘤与细胞毒性T细胞介导的杀伤的关系。因此构建了编码PBAF复合物三个特殊组份的基因单独缺失的细胞系。

首先分析PBAF复合物与肿瘤免疫的临床相关性，并得出编码PBAF复合物特殊组份的ARID2和PBRM1基因影响多种人类癌症中的肿瘤免疫。那么它使如何影响肿瘤免疫的呢？该研究通过研究PBAF复合物与免疫检查点阻断疗法的相关性证明了PBAF复合物的Pbrm1基因失活不仅使肿瘤细胞对T细胞介导的细胞毒性敏感，而且还导致更有利的肿瘤微环境。既然该复合物的功能缺失使肿瘤细胞对T细胞介导的细胞毒性敏感，那么它如何起作用的呢？通过什么途径呢？因此该研究证明了PBAF复合物的Arid2和Pbrm1突变细胞中许多代谢途径的mRNA一致地下调，特别是与mTORC1活性和胆固醇体内平衡相关的基因集，而且PBAF复合物的Arid2和Pbrm1基因通过抑制应答IFNγ基因的表达来减弱B16F10肿瘤细胞对IFNγ的应答能力，因此PBAF通过调控IFNγ和mTORC1通路使肿瘤细胞对T细胞介导的细胞毒性产生抗性。而IFNγ是肿瘤细胞和T细胞相互作用的关键细胞因子，mTORC1也是CRISPR / Cas9筛选的T细胞介导的细胞毒性的主要抗性通路。知道PBAF通过什么途径使肿瘤细胞对T细胞介导的细胞毒性产生抗性后，该研究又进一步选择了这两条途径中的IFNγ途径来研究其分子机制，由于PBAF为染色质重塑复合物，并且上文中证明了Arid2和Pbrm1基因能够抑制应答IFNγ基因的表达，那么PBAF复合物是否使通过影响染色质的可接近性调控应答IFNγ基因的转录因子的结合而调节基因的表达。结果证明了Pbrm1的失活增强了染色质对许多IFNγ诱导基因的启动子/增强子的转录因子的可接近性。

最后得出结论：对细胞毒性T细胞介导的杀伤具有抗性受肿瘤细胞中许多基因和通路调控，相应的基因产物可以代表免疫疗法的靶标，因为失活突变使肿瘤细胞对T细胞介导的攻击敏感。PBAF功能缺失增加肿瘤细胞对γ-干扰素的敏感性，导致招募T细胞效应因子的趋化因子分泌增强。当Pbrm1失活时，抗肿瘤治疗对免疫疗法变得敏感。在许多人类肿瘤中，PBRM1和ARID2的表达与T细胞细胞毒性作用基因的表达成负相关，鼠科黑色素瘤的Pbrm1缺失后被T细胞细胞毒性浸润更强烈。