U17 snoRNA调节细胞胆固醇的转运

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引言

U17 snoRNA是第一个涉及胆固醇稳态调节的H/ACA snoRNA。已知H/ACA snoRNA靶向rRNA，tRNA和小核RNA（snRNA）以通过其远端环结合靶序列进行假尿苷化。然而越来越多的证据表明缺乏与传统靶点互补的孤链H/ACA snoRNAs可能有助于修饰mRNAs。还有证据表明，snoRNAs可能像miRNA一样抑制靶mRNA的表达。

摘要：胆固醇是哺乳动物细胞生长和存活所必需的，并且是类固醇激素合成的专性前体。对具有胞内胆固醇运输缺陷的突变体通过功能丧失筛选，分离出了具有U17 snoRNA的单倍体不足的中国仓鼠卵巢细胞突变体。U17是H/ACA家族的snoRNA，其核糖体加工以外的功能以前没有被确定。通过表达谱分析，我们将缺氧型上调的线粒体运动调节因子（HUMMR）mRNA鉴定为受U17snoRNA负调控的靶标。

U17 snoRNA缺陷细胞中HUMMR的上调促进了ER线粒体接触的形成，降低了胆固醇的酯化并促进胆固醇向线粒体运输。U17 snoRNA和HUMMR在体内调节类固醇的线粒体合成并且在类固醇生成组织中发育调节，这表明U17snoRNA-HUMMR途径可以用于以前在生殖器组织成熟中未被认识到的生理作用。

图1 U17 snoRNA调节细胞胆固醇的运输

通过遗传筛选，作者鉴定了小核仁RNA U17作为细胞胆固醇稳态的调节剂。 U17通过对其靶基因HUMMR（一种外部线粒体膜衔接蛋白）的mRNA调节ER-线粒体接触以调节体内胆固醇流向线粒体和类固醇激素的合成。

1、来源于Snhg3基因座的snoRNA U17影响细胞胆固醇的转运

作者首先使用插入诱变策略在CHO细胞中进行遗传筛选，筛选出来对胆固醇酯化有影响的I5突变体。然后作者通过5’和3’RACE、Southern印迹、PCR等方法表明I5基因座表达非编码RNA。使用基因组PCR和反向PCR方法，克隆5.4-kb基因组I5基因座。基于保守启动子元件外显子/内含子和内含子H/ACA snoRNAs U17a/U17b将此基因座鉴定为小RNA宿主基因3（Snhg3）。

之后作者通过对I5基因座突变体分别用整个Snhg3基因座、U17 snoRNA和Snhg3mRNA的cDNA进行补充的回复突变（图2A和2B），通过qRT-PCR分析外源性小鼠U17snoRNA和Snhg3 mRNA的表达（图2C和2D），并通过PM-衍生的胆固醇酯化表型。结果表明整个基因组Snhg3基因座（GEN）及U17snoRNA（SNO）的表达补充了I5突变体中的胆固醇运输表型，而单独的mRNA（DAB和cDNA）表达不能补充突变表型（图2E）。互补实验的结果表明，U17 snoRNAs缺失，而不是Snhg3 mRNA，导致突变型I5中改变的胆固醇运输。

图2 snoRNA U17影响细胞胆固醇的转运

2、snoRNAU17以Hummr为下游靶标，调节PM胆固醇酯化

（1）U17不影响18SrRNA的成熟

U17 snoRNA属于H/ACA snoRNA家族，U17 snoRNA包含两个进化保守元件m1和m2，在酵母U17 snoRNA和snR30中，m1和m2元件与pre-rRNA序列碱基配对以介导pre-rRNA加工以产生18S rRNA。然而，目前还不知道这种功能是否在高等真核生物中保守。为了确定U17snoRNA的不足是否影响CHO细胞中的18S rRNA加工，通过S1核酸酶保护测定法研究了由U17 snoRNA介导的在A0位点处的47S前-rRNA的切割（图3A）。通过Northern杂交检测WT和I5突变体之间的未切割与已切割的比例没有发现差异（图3B和3C），具有U3 snoRNA相关蛋白18（UTP18）的短暂敲低（KD）细胞的作为阳性对照，WT和突变体I5之间的成熟18SrRNA的量没有差异（图3D和3E）。这个结果说明U17 snoRNA在胆固醇运输中的作用不是通过影响28S Rrna的成熟产生的。

图3 U17对18SrRNA的成熟没有影响

（2）snoRNA U17与Hummr mRNA互作，抑制Hummr蛋白表达

为了研究U17 snoRNA下游靶标和U17 snoRNA缺陷对胆固醇运输的影响，作者U17 snoRNA进行敲低和过表达，与WT细胞相比，U17 snoRNA的KD降低了40％的PM胆固醇酯化，U17 snoRNA的过表达导致相对于WT的PM胆固醇酯化增加1.5倍（图4A）。通过KD和SNO +细胞系与WT的转录组比较，鉴定出在KD中差异上调的145个基因和相对于WT在SNO +中差异下调的22个基因（图4B）。其中，只有三个在KD中上调的基因也在SNO +中下调，在这3个基因中，作者侧重选择缺氧上调的线粒体运动调节器（HUMMR），其含有与U17 snoRNA m1/m2基序互补的序列（图4C），并且其在mRNA和蛋白质水平上与U17snoRNA表达逆相关（图4D和4E）。

GST-标记的MS2结合蛋白pull-down实验结果表明下拉HUMMR使U17 snoRNA的显着富集，与WT U17 snoRNA相比，m1/m2突变的U17 snoRNA富集显着降低（图4F），表明m1 / m2元件是U17 snoRNA和HUMMR mRNA之间相互作用所必需的。为了确定U17 snoRNA表达对HUMMR mRNA的稳态水平影响，作者通过用乙烯基尿苷进行脉冲追踪标测量WT CHO和突变体I5中HUMMR mRNA的从头转录和半衰期模拟。表明WT与突变体I5之间的HUMMR转录没有差异（图4G，左），但I5突变型中HUMMRmRNA比野生型稳定（图4G，右）。

图4 snoRNA调控HUMMR的表达

（3）snoRNA U17以Hummr为下游靶标，调节PM胆固醇运动

HUMMR为外线粒体膜（OMM）蛋白质，用作线粒体运动的适配器。基于I5突变体和KD细胞系中的胆固醇运输表型，作者假设HUMMR作用于U17 snoRNA的下游以调节PM-来源的胆固醇酯化。为了检验这一假设，作者对HUMMR敲低（shHUM）或过表达（HUM）检测胆固醇酯化，结果表明HUMM上调导致胆固醇酯化减少（图5A），HUMM下调导致胆固醇酯化增加（图5B）。另外，作者对细胞进行U17 snoRNA和HUMMR的双重KD，在突变型I5（图5C）或具有U17 snoRNAKD的细胞（图5D）中HUMMR的KD导致相对于对照的酯化增加，而HUMMR过表达的KD细胞胆固醇酯化恢复至WT的酯化。表明HUMMR在该途径中在U17 snoRNA下游起作用。已知ER和线粒体之间的脂质运输发生在ER膜和OMM紧密接触的部位，通过线粒体特异性酶向27-HC的胆固醇转化（图5E，左）或孕烯醇酮（图5E，右）的评估，作者发现HUMMR过表达的CHO细胞系表现出线粒体胆固醇摄取增加。

图5 HUMMR作为U17 snoRNA的下游调节胆固醇的运动

3、Hummr与U17在类固醇生产组织中互补调节

HUMMR在类固醇生成组织中高度表达，并受小鼠下丘脑-垂体-性腺轴调节。由于胆固醇是线粒体类固醇合成的专性前体，作者检测了类固醇合成组织中的U17 snoRNA-HUMMR途径。具有较高HUMMR表达的组织表现出相对较低的U17 snoRNA表达。作者假设如果U17 snoRNA负调节HUMMR表达，那么在性腺成熟期间，HUMMR表达随着年龄增加，促进合成类固醇激素在性腺组织中的合成增加，U17 snoRNA表达则会减少。作者在出生后发育期间的小鼠卵巢组织中检测的这些基因的表达印证了观点。这些发现为U17 snoRNA / HUMMR在调节体内卵巢组织中类固醇激素产生中的生理作用提供了支持。