4受体转运成像定量
4.1前言
受体为细胞提供了对外界信号作出反应的手段，而调节细胞表面受体密度的能力使细胞能够随着时间的推移而调整其反应。在中枢神经系统(CNS)中，神经元之间信号强度的变化被认为是记忆形成的基础。导致突触信号强度增加或减少的条件也会同时导致突触上表达的受体数量的增加或减少，这表明动态的受体转运可能是有助于记忆存储的生化基础。视觉化受体运输和量化细胞表面受体表达的变化对我们了解细胞信号的许多方面都很有用。
能够分离细胞内和细胞外受体群体的方法，以及能够对受体分布进行长期监测的方法，将对许多生物系统具有重大意义，包括中枢神经系统中的突触传递。
荧光蛋白的引入，特别是被称为pHluorins的对环境pH值敏感的荧光蛋白的发现，朝着这个目标迈出了重要的一步。pHluorins最初是为了观察与释放相关的pH值变化而开发的，现在它们被用于检查进出质膜的受体转运。pHluorin荧光在酸性pH时被猝灭。将pHluorin与受体细胞外部分融合，于是，碱性细胞表面的受体比酸性细胞内受体更明亮。在本章中，我们描述了一种基于pH传感器荧光蛋白的应用，该传感器包含一个附加的、pH不敏感的荧光团。无论环境pH值如何，都可以测量受体的表达水平，可以用来校准传感器。根据两个荧光团的比值，可以将表面表达的受体与细胞内的受体区分开来。因此，两个受体群体及其相互作用可以同时被观察到。虽然最初被设计用于检测神经元中的谷氨酸受体运输，但该传感器可用于在一系列生物系统中的可视化受体运输；因为它可以被校准，还可以用来比较不同细胞之间受体的表达模式。
4.2方法与途径
4.2.1目前观察受体转运的影像学方法
在过去的20年里，激光扫描共焦显微术的广泛应用彻底改变了生物学研究；其与荧光标记抗体结合，可以探索受体表达的空间模式。然而，光学显微镜的空间分辨率通常限制在几百纳米，这使得细胞表面的受体与细胞内部的受体无法完全区分。这些局限性可以通过标记活细胞来测量表面表达，然后增加细胞膜通透性获得受体总数的办法突破。通过这种方法，可以比较实验处理前后各受体群体的比例。这项技术代表了一项重大的技术进步，超过了以往更费力的放射性配体结合和亚细胞分馏方法。然而，这两种方法都有局限性，因为它们只给出了在给定时间点上受体分布的情况。一个巧妙的改进是利用凝血酶酶切结合抗体标记来识别新插入膜的受体，从而一定程度表现出受体转运的过程。在受体的胞外部分引入组氨酸标记和凝血酶的酶切位点，首先在活细胞中识别表面受体的表达，然后在不同时间点用凝血酶选择性切割表面受体上的标记，用抗组氨酸抗体进行免疫染色从而显示受体插入的时间过程。
在过去的十年中，荧光蛋白标记受体的引入促进了受体转运的动态测量。目前已有许多技术来监测受体的转运。光漂白后的荧光恢复可以用来测量受体的扩散动力学；但是，如前所述，标准光镜技术的空间分辨率限制使得人们很难分辨细胞膜上积极参与细胞间信号传递的受体与参与细胞内管理的受体。
4.2.2 pH敏感性荧光蛋白
最初，野生型绿色荧光蛋白(GFP)及其早期变异的pH敏感性阻碍了它们用于测量受体分布，因为它们的荧光在参与受体转运的某些酸性pH细胞器内被猝灭。这一特性后来得到了利用：在5.5-7.4的生理范围内pH敏感性增强的蛋白质被用来监测与递质释放和内吞作用相关的pH变化。最近，pH敏感的荧光蛋白被标记到许多配体门控的离子通道受体和G蛋白偶联受体(GPCRs)上。pHluorins融合的N端谷氨酸受体亚单位1和2 (GluR1和GluR2)被用来监控在给予治疗长期抑郁(LTD)和长期增益(LTP)疾病后，海马神经元细胞表面α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic酸(AMPA)受体的运动。这些实验表明，化学诱导的LTP形式伴随着Spine体积的形态学变化，并且在更缓慢但不可逆的spine受体下调之前，化学LTD触发了一个可逆的胞外受体的内吞作用。pHluorins也被融合到β3 GABAA受体亚基用以检测表面受体扩散以及GPCRs，包括 mGluR7等，calcium-sensing受体，β2肾上腺素能受体和CB1大麻素受体。
日蚀和超日蚀的pHluorins，因为它们的荧光在酸性环境中会“缺蚀”或猝灭而得名。通过这种pHluorins可以直接观察与pH值变化相关的蛋白质在不同pH值的环境中的移动或暴露。然而，这些单波长传感器并不适合于定量，尤其是在不同的细胞之间，因为基线荧光水平依赖于整体的蛋白质表达水平。这无法很容易地控制，而且可能高度可变。尽管相邻细胞之间的荧光差异可能源于表面受体密度的选择性差异，但它同样可以指示总体蛋白表达的差异。因此，单波长pH值传感器的定量仅限于相对于任意基线的相对变化。
为了克服这一限制，我们开发了由pH敏感元件和不敏感元件组成的传感器。YFpH由绿色(GFPUV)和黄色(mEYFP)荧光蛋白组成，两者由一个两个氨基酸的linker连接；GFPUV在生理pH范围内对pH不敏感，mEYFP在pH 5.0 ~ 8.0之间具有较高的pH敏感性，pKa为6.8。添加pH不敏感的荧光团使总水平的重组蛋白的表达可以确定，而不管它们之间的细胞间隔。mEYFP与GFPUV发射的比值与pH值成正比；至关重要的是，因为加入了两种蛋白质，所以mEYFP:GFPUV发射比率与蛋白表达水平无关，实现了pH绝对定量。当细胞膜受体偶联了这种荧光分子后，就可以使用mEYFP: GFPUV比率区分细胞表面受体和那些位于酸性更强的endosomal隔间的受体。这一信息可以区分总体表达水平低的细胞和表达水平高但表面表达受体密度低的细胞。进一步的优势是，表面表达受体的mEYFP: GFPUV比酸性室中的受体高，因此两个细胞群可以单独识别，从而实时监测两个细胞群的动态运动。
4.2.3 YFpH融合蛋白的表征
YFpH传感器有许多潜在的用途，但它非常适合于膜蛋白运输的观察，包括上调和下调离子感受器和GPCRs的调节。值得注意的是，YFpH的光谱特征可能受到其所依附的蛋白质的影响。例如，GFP的荧光强度高度依赖于融合到其N端或c端的蛋白序列的折叠特性。因此，当融合膜蛋白亚基时，明确光谱特性至关重要：确定的GFPUV mEYFP的发射峰；确定GFPUV mEYFP之间发生有限的荧光共振能量转移(FRET)；确认GFPUV和mEYFP pH相对敏感性。此外，还必须证明标记到YFpH的蛋白质具有与野生型蛋白质类似的功能。也就是说，应该显示每个融合对的功能特性。在AMPA受体GluR2亚基等离子性受体中，YFpH标记的GluR2的药理和电生理特性及表达模式与野生型GluR2相似。另一个GPCR的例子是胆囊收缩素受体A (CCKAR)，其C端被标记为GFP，它表现出与野生型CCKARs相似的配体结合亲和力、相似的信号转导和相似的表面表达模式。
YFpH的光谱特征可以通过装有lambda扫描的共焦显微镜来评估。我们使用了一个直立的莱卡TCS SP2共焦显微镜，它配备了一个定制的灌注室和温度控制器。应该使用标准的分子生物学方法将YFpH与目标蛋白的胞外N端序列融合。如果受体需要一个信号肽来辅助表面表达，那么YFpH cDNA应该在这个序列之后插入。YFpH标记受体的质粒cDNA应转染到适当的外源表达系统中进行鉴定实验。HEK293细胞不表达内源性谷氨酸受体，是谷氨酸受体亚基实验的合适模型细胞类型。按照制造商的说明，使Effectene (Qiagen)用YFpH标记的GluR2转染HEK293细胞。转染细胞应在转染后48小时内使用，以使受体表面充分表达。在渗透细胞中，YFpH或YFpH融合结构的Lambda扫描可通过后面的方法4.1获得。
大多数配备了发射扫描的共焦显微镜都有软件包，可以自动测量荧光随波长的变化，但并非所有的都能对背景荧光进行调整。我们使用的是Igor Pro软件编写的自定义程序。加载每个激发波长和每个pH缓冲液的图像堆栈，并测量感兴趣区域内荧光的绝对变化(ROIs)，包括背景区域。由于细胞必须在几个不同的pH缓冲液中进行扫描，因此应采取预防措施以尽量减少光漂白。激光功率应保持在绝对的最低限度。
ROI应该只包含表达YFpH的区域，除了背景ROI之外，背景ROI最好包括未转染的细胞。计算每个ROI在每个波长处的平均荧光值，并减去相应的背景值。然后可以将ROI汇集起来形成一个平均值。未转染的细胞被设置成背景ROI，可确保补偿自发荧光中的波长依赖性变化。每个不同pH值下的影像都使用相同的ROI背景。在给定pH值条件下扫描的发射光扫可能直接与整个数据集的最大荧光值比对。用峰的相对强度值作图，拟合S形曲线，并预估pKa。下图所示是表达YFpH的HEK293细胞经过膜渗透处理后进行lambda扫描的实验。
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