从今天开始每次精读的文献都会在在这里展示。我是每天都想睡觉的阿源，加油！
这次精读的文献是19年发表在《Nature Plants》上文章，通讯作者是德国雷根斯堡大学的Stefanie Sprunck教授（大佬大佬），介绍了DMP8和DMP9两个蛋白介导了拟南芥中精卵融合的机制。
植物精卵融合的过程标志着植物由单倍体时代走向二倍体世代，是时代交替关键点。但是目前对于植物精卵融合的机制却还不是很清楚。目前融合过程分为三步，首先是卵细胞分泌的小肽会使精细胞激活，激活后的精细胞会与卵细胞黏附，最后实现融合。
植物精卵融合的过程
目前在这个过程中鉴定出来的仅仅只有四个组分（加上本文），卵细胞分泌的EC1小肽（共五个成员EC1.1-EC1.5），属于ECA这个大家族（基本都是在卵细胞表达，功能很冗余），介导了精细胞的激活，但是其在精细胞的上的受体还未找到。GEX2介导了精卵细胞的黏附过程。HAP2介导了精卵细胞的融合过程，本文发现了DMP8和DMP9推测其功能是辅助HAP2完成融合过程。
作者的科学问题是想通过找一些在精细胞膜上定位的跨膜蛋白从而来理解精卵融合的过程。
首先作者通过一个在线网站The GENEVESTIGATOR（专业的要付费，还挺贵）找与GEX2共表达的蛋白，利用ARAMEMNON（亲测不好用）预测了跨膜蛋白，选取了得分最高的20个跨膜蛋白。确定了具体要做DOMAIN OF UNKNOWN FUNCTION 679 (DUF679) membrane protein 9 (DMP9）这个四次跨膜蛋白。随后要对DMP这个家族要观察一下，建立演化树发现DMP8和DMP9聚在在一支上，暗示着这两货可能功能冗余,且更大的系统发生树显示这一家族在开花植物中扩展，更暗示着其在植物中的作用。
GEX2共表达的跨膜蛋白
拟南芥DMP家族系统演化树
确定了要做什么基因，下面就是老套路了。接gus（前面有人做了）和GFP看表达pattern，构建突变体看表型。
DMP8（左）和DMP9（右）蛋白定位
突变体败育情况
毫无疑问这两货都定位在精细胞膜上，并且构建的突变体显示，dmp9 单突即出现败育表型，dmp8dmp9 表型更强烈，60%的种子败育。接着套路就是看育性的缺陷是由雌方还是雄方引起的，回交实验即可做到。回交实验证明主要是雄方出的问题。紧接着就是找双受精那个阶段出了问题，最后定位到的的确确是融合过程的bug。于是乎在利用在精细胞核标上RFP的双突，在受精42小时后检查受精情况，统计发现56%双突的胚珠未正常受精且雌方时会出现单个精细胞（单次受精），两个精细胞（无受精），四个精细胞（多受精）的表型。对于单次受精的现象引起了作者极大地兴趣，利用 dmp8,9C_3 HTR10-mRFP的花粉授予EC1.1p:NLS3×GFP的植株。25%的受精胚珠存在胚乳却无胚，而无胚乳有胚的仅仅2%，单次受精主要精细胞与中央细胞的融合，暗示着DMP8和DMP9主要调控了精细胞与卵细胞的融合。
接着来作者想探讨一下，这两个蛋白是在精卵融合过程中的粘附还是融合过程起作用。于是采用原生质体实验。发现主要是融合过程出了问题。并且用egg cell plasma membrane marker时发现，59%的精细胞黏在卵细胞上还是一对，24%单个黏在卵细胞上，17%不粘附（未粘附在中央细胞）。用central cell marker DD65p:GFP也为发现未融合的细胞粘附在中央细胞上。
检测融合
由于该双突存在单次受精的表型，并且没有受精的精细胞也不粘附在中央细胞上，于是他们认为两个精细胞在爆炸释放后是紧紧联系在一起的。于是乎他们想看看是不是如他们所想。于是他们用了EC1-RNAi的材料，发现精细胞（77%）谁也不粘附，直接在珠孔端停着。17%粘附在卵细胞，7%粘附在中央细胞，并且这两个精细胞之间不分离，暗示着EC1也参与了精细胞的分离。
读完这篇文章我觉得有点混乱，因为很多结论都是来自统计上结论，可是这些结论未必都可靠，而且对于精细胞对的研究有些无逻辑，中央细胞上不存在粘附的双突精细胞，不正说明了这两个主要参与精细胞和卵细胞融合的过程吗？同时败育并不彻底，说明还存在冗余基因，此外对于该蛋白功能上的研究并不彻底，关键的功能域在哪里，同时和HAP2的关系又是怎样（作者根据功能和亚细胞定位推测激活HAP2）？期待接下来详细的研究。值得一提是，找出这两个蛋白仅仅用了一个生信软件，厉害！并且毫无疑问，这两个蛋白的确参与了精卵融合的过程，这是该领域重大的突破。
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