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影响因子：7.4
研究概述：
具有抗辐射能力的肿瘤细胞可以在放疗后逃脱细胞死亡的命运，是治疗失败的主要原因。揭示参与肿瘤重新繁殖的抗辐射细胞的机制对于癌症患者获得更好的预后至关重要。作者通过使用抗辐射细胞（来自GEO数据库）和TCGA结直肠癌的数据来筛选基因，并确定用于建立预后指标的最重要的共表达基因，测试了结直肠癌细胞系中关键基因的表达水平与关键基因敲除细胞的放射性敏感性和重新繁殖能力，建立了基于含有四个关键抗辐射基因（LGR5、KCNN4、TNS4、CENPH）的TCGA结直肠癌患者的预后指标。
结果表明，LGR5、KCNN4、TNS4和CENPH与结直肠癌细胞的辐射敏感性相关，它们组成的指标可以反映接受放射治疗的结直肠癌患者的预后。
该文章在筛选到耐药相关基因后直接构建了预后模型。在筛选到基因后，也可以后续接上肿瘤分型或者机器学习之类的方法，进一步丰富文章内容。
研究结果：
一、抗辐射细胞和TCGA患者的测序数据分析
1.作者选择数据集GSE97543作为研究对象，反复辐射建立了抗辐射的人类直肠腺癌细胞系SW1463，名为SW1463RES。与4 Gy辐射后的对照细胞相比，当在DEGs分析中将截止值设置为|Log2折叠变化|≥1和P.值≤0.05时SW1463RES呈现了710个上调基因和1954个下调基因（图1A）。对这组基因进行基因本体（GO）分析和途径分析，这些基因主要丰富于：（1）细胞周期相关途径；（2）DNA复制和修复相关途径；（3）应激反应路径（图1B）。
2.作者在TCGA-COAD/READ数据库中进一步进行了肿瘤与正常组织的DEGs分析，获得了3669个上调基因，同时发现了5477个下调调节基因（图1C）。通过使用Venn图与两组的上调基因相交，最终发现了252个共上调基因（图1D）。图1E显示TCGA和GEO数据库中选择的具体项目，可视化流程图（图1F）描述了使用这些基因表达数据来建立实践的详细过程。
二、筛查与结直肠癌临床结果相关的关键抗辐射基因
1.在TCGA数据库中选择了35名接受放疗的结直肠癌患者，在上述252个共表达的上调基因中，共有五个基因（LGR5、KCNN4、PTRH1、CENPH、TNS4）被认为与单变量Cox回归模型结果患者的PFS有关。在这些五个基因中，LGR5、KCNN4、CENPH和TNS4是风险因素，将这四个基因进一步纳入多变量回归分析。作者使用多元Cox回归和关键基因的mRNA表达中的系数来建立一个计算风险评分的公式：风险评分=（CENPH0.2551 + LGR50.05586 + KCNN40.02614 + TNS40.01099）。这四个基因表达高的患者在接受放疗后更有可能出现肿瘤进展（图2A）。
2.所有35名患者都根据中位风险评分分为两组，其中17名患者在高风险组，其余在低风险组（图2B，C）。如图2C所示，放疗后风险评分较高的患者更有可能发生肿瘤进展，其中位无进展生存率相对较短。根据单个关键基因的表达构建无进展生存曲线时，只有一个基因可以获得具有统计学意义的结果；但当根据风险评分对患者进行分组时，高风险组在3年、5年甚至更长的进展率明显高于低风险组（图2D）。基于抗辐射基因面板，引入了ROC曲线来反映该模型预测预后的能力，AUC为1、3和5年曲线分别达到0.87、0.94和0.9，这进一步表明了可靠的预测能力（图2E）。
三、四个基因是预测肿瘤进展的最佳组合
通过构建一系列具有单个基因或具有多个基因的组合的回归模型，作者比较了各种情况下的AUC值（图3A）。在各种组合中，包括所有四个关键生物标志物的组合具有最高的AUC值，0.827，代表最佳预测能力（图3B）。图3C-E显示了三种组合，其AUC值略低于最高值，分别达到0.823、0.817和0.801。
四、应用WCGNA将抗辐射基因和临床特征联系起来
作者构建了无尺度网络分析（图4A），最终得到了一个由13个模块组成的合并模块（图4B）。每个模块与临床试验、PFS和风险评分之间的定量联系如图4C所示。四个关键基因分别被聚类到四个不同的模块中（图4D）。KCNN4聚集在鲑鱼模块中，风险评分为0.119 Cor.和- 0.05 PFS Cor.，而棕色模块中的TNS4风险评分为0.206 Cor.和0.036 PFS Cor。对于这两个基因，高风险评分对应于PFS中相对负面的结果。虽然绿黄色模块中的LGR5（0.032风险评分Cor.，0.115 PFS Cor.）和灰色模块中的CENPH（-0.099风险评分Cor.，0.089 PFS Cor.）被归类为低风险评分和良好的PFS结果模块，但根据Cox回归模型中的危害比，这两个应该是风险因素（图2A）。此外，对这四个模块中的基因进行了GO富集分析。结果主要表现为放疗后释放处于压力状态的细胞内物质引起的细胞周期控制相关途径和免疫相关途径的激活（图4E-H）。
五、验证其他类型肿瘤和体外抗辐射基因PANEL与肿瘤再繁殖的相关性
1.在TCGA数据库中的其他类型的肿瘤中，作者选择了接受放疗的BRCA（n = 38）、LUAD（n = 36）和CESC（n = 20）患者作为唯一辅助治疗，以进一步证明假设。在三种肿瘤的患者中也建立了多变量逻辑回归分析，图5a、c和e中列出了每种癌症的前5个AUC值的基因组合。对于接受放疗的乳腺癌患者，包含所有四个基因的预测模型达到了最高的AUC值，0.974（图5b）。没有LGR5的预后模型在LUAD患者中效果最好，AUC值为0.861（图5d）。在CESC患者中，最高AUC值为0.745是由KCNN4和TNS4构建的模型（图5f）。
2.作者还选择了两个结直肠癌细胞系HT29和HCT116进行克隆形成分析。在暴露于各种剂量的辐射后，HT29的菌落形成能力明显高于HCT116，这意味着HT29细胞对辐射的抵抗力更强（图5G）。与此同时，两个细胞中辐射抗性基因的基本表达总体上与预期一致，只是KCNN4在HCT116中的基线更高（图5H）。
六、基因敲除结直肠癌细胞系的放射敏感性
作者1.分别使用shRNA构建了四个基因敲除细胞系，并通过Western Blot实验选择了具有更好的敲除效果的HCT116细胞系（图6A）。然后用这些细胞进行了克隆形成分析（图6B）。在未经治疗的组中可以观察到CENPH和LGR5敲除细胞的克隆能力下降，而KCNN4和TNS4敲除细胞的能力没有显著影响（图6C）。当在8 Gy辐照后进行治疗时，CENPH敲除细胞几乎无法形成克隆，而其他三个基因敲除细胞只能形成少数克隆（图6B）。与对照组相比，放射治疗后所有敲除细胞的复制能力都下降（图6C）。在Ht29细胞中也进行了相同的基因敲除和克隆检测，以进一步验证。
研究总结：
本研究中，作者通过对GEO数据库中的抗辐射性项目和TCGA-COAD/READ数据库中的肿瘤与正常组织项目的分类和分析，在接受放射治疗的结直肠癌患者中建立了一个基因小组（LGR5、KCNN4、TNS4和CENPH）。它反映了耐辐射性和肿瘤重新繁殖之间的关系，并被证实是结直肠癌预后的可接受指标。这些分子可能会成为结直肠癌患者放疗后预测肿瘤重新繁殖的新靶点。
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