单细胞测序技术使得细胞异质性信息能够被充分挖掘。在单细胞转录组测序技术出现之后，其他单细胞组学技术也陆续出现并和单细胞转录组一起被广泛应用，单细胞多组学也在2019年被评为年度技术。目前，单细胞多组学联合似乎已经成了CNS级别单细胞研究的标配。
2021年7月8日，加州大学的研究人员在期刊《Nature Genetics》首次报道了利用单细胞多组学（snRNA-seq和snATAC-seq）揭示阿尔茨海默症分子变化的研究。该研究通过单细胞多组学数据的联合分析，阐明了阿尔茨海默症的基因调控前景，强调了胶质细胞在阿尔茨海默症病理生理学中的作用，确定了少突胶质细胞中SREBF1 等关键基因的调控机制，提供了对阿尔茨海默病分子变化的更完整理解。该研究的策略和思路也为利用单细胞多组学进行其他疾病研究提供了参考。
一、研究背景
人脑由多个异质的细胞亚群组成，神经元和非神经元细胞协同工作，协调着不同细胞类型的生物过程。阿尔茨海默症（AD）等神经退行性疾病以大量神经元丢失为特征并伴有胶质增生，但特定神经元和胶质细胞群在阿尔茨海默症病理生理学中的作用尚不清楚。对AD等复杂疾病的GWAS表明，很大一部分遗传风险来自常见变异向远端调控元件的分配，这些调控元件通常是疾病相关组织中的细胞类型特异性区域。
二、研究方法
对来自晚期AD患者死后和年龄匹配的认知健康对照脑前额叶皮层同时进行snATAC-seq（n = 12个晚期AD；n = 8个对照）和snRNA-seq（n = 11个晚期AD；n = 7个对照）。
图1 实验设计（图片引自文献[1]）
三、研究结果
1、人前额叶皮层的多组学分析
利用snATAC-seq和snRNA-seq描绘了大脑的所有主要细胞类型，包括兴奋性神经元（EX）、抑制性神经元（INH）、星形胶质细胞（ASC）、小胶质细胞（MG）、少突胶质细胞（ODC）和少突胶质祖细胞（OPC），其中少突胶质细胞是最常见的细胞类型。两种数据独立分类的细胞类型在整合的UMAP空间中组合在一起，在共同构建的空间中高度重叠，通过基因活性和基因表达确认了细胞身份。
图2 单核ATAC-seq和单核RNA-seq揭示患病大脑的细胞多样性（图片引自文献[1]）
2、阿尔茨海默症细胞异质性多组学表征
在snATAC-seq和snRNA-seq细胞聚类中发现了多个神经元和神经胶质亚群。与对照样本相比，晚期AD中ASC3与疾病的比例显著增加，而ASC4显著降低；MG.a和MG.b的比例在晚期AD中增加，两者都对应于激活的snRNA-seq簇MG1，后者也随疾病增加；免疫少突胶质细胞群ODC13在AD晚期显著增加。远端和近端差异可及染色质区域以及DEGs的GO富集具有高簇特异性。这些可能是神经退行性变中不同细胞亚群中不同生物途径失调的基础。
图3 阿尔茨海默症前额叶皮层中表观遗传和转录不同的细胞亚群（图片引自文献[1]）
3、晚期阿尔茨海默症的细胞类型特异性顺式调控
鉴定了56,552个基因连接的候选顺式调节元件（gl-cCREs）和11,440个候选顺式调节元件（cCRE）连接的基因。除了细胞类型特异性的基因之外，在多种细胞类型中共享大量具有连锁cCRE的基因。cCRE连接的基因和细胞类型标记差异表达基因（DEGs）以及在该细胞类型内AD中上调的基因之间有显著重叠，突出了cCREs在疾病相关基因表达变化中的关键作用。这些gl-cCREs在每个snATAC-seq簇中的染色质可及性具有高度的细胞类型和簇特异性。
图4 顺式调控元件与特定细胞类型下游靶基因的关联（图片引自文献[1]）
4、晚期阿尔茨海默症中的细胞类型特异性转录因子
在snATAC-seq小胶质细胞簇中的SPI1 Motif变异仅在上调的簇MG.a和MG.b中显著增加，但SPI1的靶基因仅在MG1中显著下调。NRF1在选定的少突胶质细胞群中失调。SPI1在晚期AD中充当转录阻遏物，由NRF1失调介导的线粒体功能受损可能通过髓鞘形成的破坏导致晚期AD的神经元功能障碍。在小胶质细胞特异性和少突胶质细胞特异性TF调节网络中，除了位于已知AD GWAS位点的基因外，发现了多个AD DEGs，由小胶质细胞中的SPI1和少突胶质细胞中的NRF1调节。
图5 晚期阿尔茨海默症中细胞亚群特异性的转录因子调控（图片引自文献[1]）
5、少突胶质细胞中SREBF1的失调
在使用来自snATAC-seq和snRNA-seq的细胞核构建的整合少突胶质细胞轨迹中，来自晚期AD样本的细胞核比例似乎沿着轨迹增加。成熟的ODC基因表达信号在轨迹末端增加，而形成髓鞘的少突胶质细胞（MF-ODC）基因信号减少；新形成的少突胶质细胞（NF-ODC）基因特征在整个轨迹中减少，表明拟时轨迹再现了少突胶质细胞的成熟。少突胶质细胞gl-cCREs的染色质可及性沿轨迹DGEs（t-DEGs）显示了大量染色质重塑和转录重编程，这可能是少突胶质细胞成熟的基础。在AD晚期，少突胶质细胞中NRF1 Motif变异上调，并且少突胶质细胞中SREBF1 Motif的变异性随着疾病而下调。NRF1在轨迹的末端与靶基因负相关，而SREBF1在轨迹的开始和结束都与靶基因正相关，表明SREBF1在整个轨迹中充当转录激活因子。
图6 少突胶质细胞多组学细胞轨迹分析（图片引自文献[1]）
6、疾病相关小胶质细胞轨迹
在小胶质细胞整合细胞轨迹中，晚期AD样本的细胞核比例在整个小胶质细胞轨迹中显著增加，细胞轨迹显示稳态信号的减少，TREM2非依赖性阶段疾病相关小胶质细胞（DAM）信号的增加和TREM2依赖性阶段DAM信号明显整体耗竭，表明这种小胶质细胞轨迹描述了从稳态向疾病相关细胞状态转变过程中的转录和表观遗传变化。SPI1 Motif轨迹与轨迹末端的基因呈负相关，表明SPI1在晚期AD中充当阻遏物。
图7 小胶质细胞多组学细胞轨迹分析（图片引自文献[1]）
7、疾病相关星形胶质细胞轨迹
在整合的星形胶质细胞轨迹中，晚期AD细胞核的比例在整个轨迹中显著增加，该轨迹遵循从低GFAP 状态到高GFAP 状态和类疾病相关星形胶质细胞（DAA）的趋势。两种转录因子CCCTC结合因子（CTCF）和FOSL2的Motif变异在晚期AD中分别下调和上调。CTCF Motif变异轨迹与DAA和高GFAP 信号（轨迹终点）以及轨迹的GFAP 低相位中的t-DEGs正相关（图6l）。或者，我们发现FOSL2的基序变异轨迹与GFAP-high和DAA基因呈正相关，与轨迹末端的基因呈正相关（图6l）。这些结果表明FOSL2可能是DAA信号的激活剂，而CTCF可能促进更稳定或无疾病的星形胶质细胞状态。
图8 星形胶质细胞多组学细胞轨迹分析（图片引自文献[1]）
8、遗传风险位点细胞类型特异性顺式调控
小胶质细胞簇MG.b和MG.c对AD GWAS SNPs显著富集。精细定位AD相关多态性沿小胶质细胞假时轨迹的富集显著增加，突出了DAM中远端增强子的AD相关SNPs。GWAS基因中的致病变异破坏了潜在顺式调控关系，如BIN1、ADAM10、APOE 和SLC24A4 。
图9 阿尔茨海默症GWAS位点的细胞类型特异性调控（图片引自文献[1]）
9、单细胞共表达网络
对少突胶质细胞的单核一致加权基因共表达分析发现OM1、OM2、OM4和OM5四个共表达模块与AD诊断显著相关。三个少突胶质细胞模块明显富含SREBF1的靶基因，表明SREBF1在调节这些模块中的基因表达方面非常重要。SREBF1靶基因的模块特征基因表达在早期和晚期AD样品中在蛋白和RNA水平下调。
图10 共表达网络分析揭示基因表达模块（图片引自文献[1]）
四、总结
该研究对191,890个来自阿尔茨海默病死后人脑组织和认知健康对照进行了snRNA-seq和snATAC-seq联合分析，为阿尔茨海默症的分子变化提供了更完整的理解。基于染色质可及性确定了细胞类型特异性的候选顺式调节元件（cCREs），并发现了疾病相关的细胞亚群特异性转录组变化；确定了可能调节阿尔茨海默症基因表达变化的转录因子；整合的拟时间轨迹分析在表观基因组和转录组水平上广泛表征了疾病相关的神经胶质细胞状态；将阿尔茨海默症风险信号与它们可及的特定细胞类型联系起来，并定义了这些位点的顺式调控染色质可及性网络。总之，该研究阐明了阿尔茨海默症的基因调控前景，强调了胶质细胞在阿尔茨海默症病理生理学中的作用，并确定了少突胶质细胞中SREBF1 等基因的调控机制。
参考文献：
1. Morabito, S., Miyoshi, E., Michael, N. et al. Single-nucleus chromatin accessibility and transcriptomic characterization of Alzheimer’s disease. Nat Genet (2021).
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