肝癌（HCC）是世界上常见的恶性肿瘤之一，但HCC的表型和分子异质性使其对常规化疗和靶向治疗具有高度耐药性。单细胞测序是研究肿瘤微环境中细胞成分及其相互作用的有力工具，已被广泛应用于大量肿瘤异质性研究。目前，单细胞测序技术已经为肝癌免疫微环境、免疫细胞动态、微环境重编程、克隆进化以及免疫逃避机制提供了深入见解。
一、单细胞测序揭示早期复发肝癌特征性免疫图谱
文章名称：Single-cell Landscape of the Ecosystem in Early-relapse Hepatocellular Carcinoma
发表期刊：Cell
影响因子：38.613
发表时间：2021年1月
发表单位：复旦大学中山医院肝癌研究所等
（图片引自文献[1]）
1、研究方法
研究组：12例原发肝癌的肿瘤（PT）和邻近非肿瘤组织（PNT）以及6例早期复发肝癌患者的肿瘤（RT）和邻近非肿瘤组织（RNT），进行全外显子测序，并利用FACS分选出CD45+与CD45-细胞进行单细胞全长转录组测序。
验证组1：4例PT和RT，进行10x Genomics单细胞转录组测序和TCR测序。
验证组2：对47例PT和RT的FFPE样本进行免疫组化（IHC）和RNA-seq。
2、研究思路
3、研究结论
（1）早期复发肝癌具有独特的免疫生态系统
与原发性肝癌相比，早期复发性肝癌具有更多的树突状细胞和CD8+T细胞，而Treg细胞和增殖T细胞减少，表现出独特的免疫生态特征。
（2）CD8+T细胞动态免疫状态分析
原发性肝癌和复发肝癌样本中的CD8+T细胞表现出相同的过渡轨迹，但显示出显著不同的免疫和转录状态，提示在原发性和复发性肝癌的治疗中应考虑不同的免疫治疗策略。
（3）原发性肝癌CD8+T细胞特征性亚群分析
复发肝癌中CD8+T细胞过表达KLRB1，表现出先天样功能障碍状态，具有较低的细胞毒性和免疫抑制表型，与原发性样本不同。高表达KLRB1的CD8+T细胞的特征基因与不良预后和肿瘤进展相关。
（4）复发性恶性细胞介导抗肿瘤免疫应答
恶性细胞在复发性肝癌中表现出增强的免疫逃避能力和减弱的细胞增殖。复发肝癌细胞PD-L1与DC细胞的CD80分子互作相关性最显著，可通过PD-L1-CD80和CTLA4-CD80损害DC细胞中的抗原递呈，从而在早期复发的HCC中形成抗肿瘤免疫。
二、肝癌内皮细胞重编程促进免疫抑制性巨噬细胞的产生
文章名称：Onco-fetal Reprogramming of Endothelial Cells Drives Immunosuppressive Macrophages in Hepatocellular Carcinoma
发表期刊：Cell
影响因子：38.631
发表时间：2020年10月
发表单位：新加坡基因组研究所等
（图片引自文献[2]）
1、研究方法
14例肝癌（HCC）患者和1例健康捐赠者的57个区域组织进行10x Genomics单细胞转录组测序。
12周和14周人胚胎肝脏组织进行10x Genomics单细胞转录组测序。
2、研究思路
3、研究结论
（1）HCC中胎儿相关内皮细胞和巨噬细胞鉴定
肿瘤和邻近组织中发现特异的内皮细胞（EC）及巨噬细胞。RNA速率分析发现肿瘤特异性PLVAP+EC可能来自中间的EC亚群，肿瘤相关巨噬细胞（TAM1）是胚胎来源的驻留于组织中的巨噬细胞 （TRM）。表明在HCC中的巨噬细胞可能被重新编程成胚胎样表型。
（2）HCC中TAM1具有胚胎样重编程
质谱流式和原位杂交验证了单细胞图谱结果，提示肝癌中存在与胎儿相关的PLVAP+ EC和胚胎样FOLR2+TAM1。增加14周和18周人类胚胎肝脏单细胞数据发现，FOLR2+TAM1在HCC中与胚胎巨噬细胞表现出显著的相似性，表明HCC中TAMs具有胚胎样重编程。
（3）胚胎肝脏和HCC之间存在共享的免疫生态系统
空间转录组学进一步揭示胎儿肝和HCC之间的肿瘤-胎儿生态系统共享。基因调控分析、免疫荧光和体外功能分析表明，VEGF和NOTCH信号通路在维持肿瘤-胎儿生态系统中起着重要作用。
三、肿瘤细胞生物多样性驱动肝癌微环境重编程
文章名称：Tumor Cell Biodiversity Drives Microenvironmental Reprogramming in Liver Cancer
发表期刊：Cancer Cell
影响因子：26.604
发表时间：2019年12月
发表单位：美国国家癌症研究所等
（图片引自文献[3]）
1、研究方法
9例肝癌（HCC）患者和10例肝内胆管癌（iCCA）患者进行10x Genomics单细胞转录组测序。
2、研究思路
3、研究结论
（1）HCC和iCCA具有转录组多样性
聚类分析发现有些细胞高表达上皮基因，揭示潜在的原癌性。CNV预测区分恶性和非恶性细胞，恶性细胞具有患者特异性特征。恶性细胞相关性分析进一步揭示瘤内转录组的多样性。
（2）肿瘤转录组多样性与患者预后相关
开发肿瘤细胞转录组多样性得分方法，将肿瘤样本分为多样性高组（Div-High）和多样性低组（Div-Low）。多样性高组患者生存期明显低于多样性低组。iCCA患者的多样性明显高于HCC患者。
（3）恶性细胞中VEGFA的表达与免疫微环境（TME）重编程有关
VEGFA主要在恶性细胞表达，其表达与肿瘤多样性呈正相关，与iCCA和HCC患者的总生存率显著降低相关。揭示VEGFA可能重新编程肿瘤免疫微环境，影响患者预后。
（4）T细胞在多样性高和多样性低肿瘤中有不同作用
低转录多样性肿瘤的T细胞富含干扰素-a (IFN-a)/IFN-g反应和MYC活性，提示细胞溶解活性。免疫检查点分子在多样性低肿瘤的T细胞中表达更高。T细胞活性相关基因与患者预后相关，在多样性高和多样性低肿瘤中有不同的作用，可能是肿瘤免疫监测状态的一个指标。
四、单细胞测序揭示肝癌免疫微环境动态特征
文章名称：Landscape and Dynamics of Single Immune Cells in Hepatocellular Carcinoma
发表期刊：Cell
影响因子：38.631
发表时间：2019年8月
发表单位：北京大学等
（图片引自文献[4]）
1、研究方法
16例肝癌（HCC）患者的癌、癌旁、淋巴结、血液和腹水，分选CD45+细胞，进行10x Genomics单细胞转录组测序。
1例肝癌患者的癌、癌旁、淋巴结、血液和腹水进行Smart-seq测序。
2、研究思路
3、研究结论
（1）单细胞数据揭示了HCC中高分辨率的动态免疫微环境
进一步聚类分析T细胞、B细胞、NK细胞和髓系细胞等主要亚群，在不同组织中有不同的富集特征。来自腹水的淋巴细胞与外周血相似，髓系细胞与肿瘤来源细胞相似。RNA速率分析和线粒体突变进化树分析确认巨噬细胞从肿瘤到腹水的迁移过程。
（2）肿瘤富集巨噬细胞的两种不同状态
肝癌巨噬细胞表现出两种状态：TAM-like和MDSC-like。TAM-like的特征基因SLC40A1和GPNMB与不良预后有关。CRISPR验证这2个基因在细胞炎症反应中起重要作用。
（3）LAMP3+DC具有向淋巴结转移和与多种淋巴细胞互作的能力
肝癌中发现一个特殊的细胞亚群LAMP3+DC，表达与成熟和细胞迁移相关的特征基因。体外实验，RNA速率分析和线粒体突变进化树分析证实LAMP3+DC具有向淋巴结迁移的潜力。受体配体分析及免疫组化验证发现LAMP3+DC具有与多种淋巴细胞相互作用的潜力。
五、总结
以上研究深入解析了肝癌生态异质性及免疫微环境，为肝癌研究提供了有价值的数据资源，有助于更加深入的了解肝癌发病机制，助力开发更有效的肝癌免疫治疗靶点和生物标志物。
参考文献：
1. Sun Y, Wu L, Zhong Y, et al. Single-cell Landscape of the Ecosystem in Early-relapse Hepatocellular Carcinoma[J]. Cell, 2020, 184(2).
2. Sharma A, Seow J, Dutertre C A, et al. Onco-fetal Reprogramming of Endothelial Cells Drives Immunosuppressive Macrophages in Hepatocellular Carcinoma[J]. Cell, 2020, 183(2).
3. Ma L, Hernandez M O, Zhao Y, et al. Tumor Cell Biodiversity Drives Microenvironmental Reprogramming in Liver Cancer[J]. Cancer Cell, 2019, 36(4).
4. Zhang Q, He Y, Luo N, et al. Landscape and Dynamics of Single Immune Cells in Hepatocellular Carcinoma[J]. Cell, 2019, 179(4):829-845.e20.
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