HEK293T细胞传代操作

Author:JunfeiXie
Date:10/03/2022

1. 胰酶消化/离心标准操作：

T25细胞培养瓶总体积约为5ml，贴壁细胞经过胰蛋白酶（1-2 ml）消化后加入含血清培养基中和，补足至5ml，按照1:2、1:3、1:4、1:5、1:6比例传代，则相应的体系为：

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关于细胞转染：

1. 细胞铺板后至汇合度达到80%以上，即可进行转染，适当增加细胞数量可在铺板后8-12小时进行转染；
2. 用去内毒素试剂盒提取质粒DNA，mimic终浓度在50nM-100nM之间，最终DNA含量为质粒DNA+mimic的含量，控制在1000ng以内，推荐脂质体1.5ul，若毒性大可适当减少用量，转染6-8h更换为正常培养基，继续培养24h-36h后收获细胞，用于双荧光素检测；
3. 针对24孔板，加入脂质体复合物体积为100ul，覆盖住细胞表面，转染后吸弃再加入500ul新鲜培养基；
4. 若用其他无需去血清转染试剂，可以省略换液操作，加入转染复合物后直接加入培养基。

2. 快速传代（免离心）操作：

按照1:2、1:3、1:4、1:5、1:6比例传代，在加入胰蛋白酶（1-2 ml）消化，然后倾斜培养瓶，用枪头吹打瓶底面积2/3，3/4，5/6，6/7区域，之后吸走胰蛋白酶和细胞溶液，加入5ml含血清培养基，并继续吹打剩余部分细胞。

注意：控制好消化时间（<1min），过度消化容易导致细胞流失；

3. 简单铺板用于转染：

取5ml培养基消化后吸弃胰蛋白酶，然后用适量新鲜培养基吹打细胞，全部转移至50ml离心管中，添加培养基补足至17ml或20ml（实际稀释比例为1:2.4或1:3），取12ml用于24孔板铺板，取5ml用于传代培养，其余丢弃。

事实上，细胞传代应在细胞长满或即将长满皿底时候进行传代，过度生长的细胞状态不佳，影响转染效率；
传代比例不宜过稀，细胞数目过少影响生长;

生长恰当
生长过度