Q5 Site-Directed Mutagenesis

我的实验目的1 ：是给VDR的N端加150个碱基，因为此试剂盒只能一次最多加100个碱基，所以我们分2次试验，
F1：gtcgatggtgctcagaactgctggagtggaggggATGGAGGCAATGGCGGCC
R1：agccaatcgctccttttcttattcctccactccatTATCGATGAATTCGCGGCCG

实验目的2：给突变的CYP24A1的质粒还原

Step1：（试剂盒减半）

Q5 hot Start High-Fidelity 2X Master Mix：5ul
F1 ：1ul
R1：1ul
Template DNA（稀释到25ng/ul内）：1ul
water：2ul

PCR反应条件：

98度 30s
98度10s
50-72度：30s（根据引物选择退火温度：F1/R1=69;F2/R2=67;F3/R3=61)
72度3min 25个circle
72度10min
4度持续

step2

PCR product :1ul

2X KLD Raction Buffer: 5ul

10x KLD enzyme Mix:0.5ul
Nuclease-free Water: 3.5 ul
室温20min

然后做转化。