TITLE****：Chloroplast genome variation and phylogenetic relationships of Atractylodes species
译名：苍术属植物叶绿体基因组变异及系统发育关系
期刊：BMC Genomics
日期：2021年2月
下载链接：https：//doi.org/10.1186/s12864-021-07394-8
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研究介绍
苍术是应用广泛的中草药白术、苍术的基本原植物，为东亚特有属。属内种的形态差异很小，通用的DNA条码不能清楚地区分系统关系或识别属的物种。为了解决这些问题，利用高通量测序技术对苍术属所有物种的叶绿体基因组进行了测序。本研究对6种苍术属植物的叶绿体基因组进行了测序和组装，为该属植物提供了宝贵的基因组资源。基于整个叶绿体系统发育分析，属内的关系首次得到明确的解决。同时，叶绿体基因组的比较分析产生了可变区，这些可变区可以作为特定的DNA条形码。
研究目的
本研究对苍术叶绿体基因组的序列和结构变异、系统发育和突变动态进行了研究，为今后的种群遗传学、分类学和物种鉴定等方面的研究奠定了基础。
材料与方法
材料：
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图1、苍术属植物形态的比较。比例尺为5厘米。
A A. carlinoides, B A. macrocephala, C A. lancea, D A. japonica, E A. coreana, F A. chinensis
方法：
1、测序、基因组装及注释
Illumina HiSeq X Ten平台上进行PE150测序，通过使用SPADS 3.6.1程序（Kmer=95），从高质量的配对末端读数组装重叠群。在此基础上，利用BLAST程序，以中国白杨叶绿体基因组（NC037484）为参照，筛选叶绿体基因组重叠群。随后，使用Sequencher 4.10组装所选的重叠群。Geneious 8.1用于将所有读数映射到组装的叶绿体基因组序列，以验证组装的准确性。完整的叶绿体基因组序列使用Plann注释，使用A. chinensis（NC037484）作为参考，并用OrganellarGenomeDRAW绘制环图。
2、微结构突变事件的分析
使用MAFFT V7软件比对6个叶绿体基因组，并使用Se-al 2.0进行手动调整。使用 MEGA 7.0分配叶绿体基因组中的可变突变位点和简约信息位点。使用基因组范围微卫星分析工具包（Gmata）软件预测简单序列重复序列（SSR），并设置搜索参数 单核苷酸重复单元 > 10，二核苷酸重复单元 > 5，三核苷酸重复单元 > 4，四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸 SSR 重复单元 > 3。基于对齐的序列矩阵，手动验证插入缺失并将其分为两类，包括SSR相关和非SSR相关（正常插入缺失/indels）。A. chinensis 被用作确定indels事件的大小和位置的参考。
3、叶绿体基因组的比较和分歧热点识别
用mVISTA程序以Shuffle-LAGAN模式对苍术叶绿体全基因组进行比较。以A . chinensis序列为参考。利用DnaSP v5.10软件进行滑动窗口分析，计算叶绿体基因组的核苷酸多样性。窗口长度设置为600bp，步长为100bp。苘麻具有优良的形态，其他5个种被用作中药。为此分析创建了两个数据集：（1）所有6个物种数据集（A组）和（2）5个医学物种（B组）。
4、系统发育重建
采用37个叶绿体基因组序列进行系统发育分析，其中包括6个苍术样本和31个GenBank中其他物种的Cynareae和Lactuceae样本。所有叶绿体基因组序列采用MAFFT进行比对，不明确比对区域采用gblock 0.91b进行裁剪。系统发育分析采用最大似然（ML）和贝叶斯推断（BI）方法。Modelfinder根据软件推荐的BIC标准计算出最优模型TVM + F + I + G4。使用IQ-tree进行ML计算，重复采样1000次。利用MrBayes实现系统发育的贝叶斯推断（BI）。马尔科夫链蒙特卡洛（MCMC）分析运行了1000万代。这些树每1000代取样一次，初始的25%作为老化处理丢弃。最后验证分裂频率的平均标准差<0.01。采用MEGA 7.0 in ML方法对获得的indel数据（包括SSRs）进行系统发育分析。
结果
表1. 六种苍术属植物叶绿体基因组基本信息
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图2苍术属叶绿体基因组基因图谱。大圆圈内侧的基因是顺时针转录的，而外侧的基因是逆时针转录的。这些基因是根据其功能进行颜色编码的。虚线区域代表叶绿体基因组的GC组成。
表2、六种苍术属植物叶绿体基因组的基本信息
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含有内含子的基因用星号(*)标记
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图3、苍术叶绿体基因组的Indels分析。
(A) Indels类型和位置的频率。(B)6个苍术叶绿体基因组中非SSR相关Indels的数量和大小
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图4、6个苍术叶绿体基因组中SSR的类型和分布。
(A)在LSC、SSC和IR区域出现的频率。(B)SSR在不同物种中的分布比例。(C)不同重复类型中已鉴定的SSR motif数量。(D)SSR重复类型数量。
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图5、以A. chinensis为参照的6种苍术属植物叶绿体基因组的mVISTA可视化比对分析。x轴代表叶绿体基因组中的坐标。对齐区域的序列相似性在50%-100%
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图6、整个叶绿体基因组的滑动窗分析。
(A)所有六种苍术。(B)五种用于草药，不包括A. carlinoides。窗口长度：600 bp，滑动长度：100 bp。x轴：窗口中点的位置。y轴：每个窗口的核苷酸多样性。
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图7、基于来自37个不同物种的完整叶绿体基因组，使用最大似然法和贝叶斯推断法构建系统进化树。分支上方的数字代表最大似然自举值/置信区间后验概率。
结论
结果表明苍术植物叶绿体基因组具有典型的四方结构，大小在152,294~ 153,261 bp之间。基因组共有113个基因，包括79个蛋白质编码基因、30个tRNA基因和4个rRNA基因。鉴定出了4个热点区，分别为rpl22-rps19-rpl2、psbM-trnD、trnR-trnT（GGU）和trnT（UGU）-trnL，以及总共42-47个简单序列重复（SSR）分子标记，这些被认为是最有希望进行物种划界和种群遗传研究的潜在变量标记。整个叶绿体基因组的系统发育分析表明，苍术是菜蓟的一个分支；苍术属物种形成了一个单系，清楚地反映了属内的关系。
END
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