A Novel Lactate Metabolism-Related Gene Signature for Predicting Clinical Outcome and Tumor Microenvironment in Hepatocellular Carcinoma
预测肝细胞癌临床结果和肿瘤微环境的新型乳酸代谢相关基因特征
发表期刊：Front Cell Dev Biol
发表日期：2022 Jan 3
doi:2022 Jan 3
一、背景
肝细胞癌（HCC）是原发性肝癌最常见的组织学类型，是全球癌症死亡的第三大原因。然而，晚期肝细胞癌的治疗结果仍然不令人满意，即使在成功根除肿瘤后，肝细胞癌的复发率也非常高。肿瘤细胞的代谢改变不仅有利于细胞增殖，而且通过释放代谢物，特别是乳酸，对抗肿瘤免疫有深刻的影响。因此，确定代谢相关特征以评估TME和提高免疫治疗的治疗效果至关重要。
与正常细胞不同，即使在充足的氧气条件下，肿瘤细胞也会代谢葡萄糖，产生乳酸。乳酸盐的积累提供了一个酸性的微环境，有利于肿瘤的生长和发展。此外，有氧糖酵解产生的乳酸可以作为一种信号分子分泌到细胞外环境中，以调节细胞间的相互作用。鉴于乳酸在肿瘤发生和免疫抑制TME中的重要作用，针对其代谢有望成为癌症治疗的有效手段。
二、材料与方法
1.数据来源
(1)TCGA-HCC队列作为训练集
(2)从ICGC网站下载一个独立的HCC数据集，ICGC-LIRI-JP队列作为验证集
(3)从MolecularSignatures数据库中检索到289个LMRG；从Cistrome下载与癌症相关的转录因子
2.实验流程
(1)差异表达的LMRG和转录因子：在TCGA-HCC队列的50个正常组织和374个肿瘤组织之间进行了差异表达分析；使用R中的 "clusterprofiler "包进行GO和KEGG富集分析
(2)LMRGS的构建和评估：对差异表达的LMRGs进行单变量Cox回归分析，以确定具有预后价值的LMRGs；使用 "glmnet "软件包进一步进行了LASSO Cox回归；通过LASSO回归筛选后，选定的LMRGs被应用于通过多变量Cox回归分析建立LMRGS；主成分分析（PCA）被用来评估该特征的分类准确性；生存分析；应用Cox风险回归模型来确定LMRGS作为OS的独立预测因素
(3)建立nomogram：为了预测HCC患者的1、3、5年生存率，根据LMRGS和重要的临床病理参数构建了nomogram
(4)TMB的计算：为了计算每个HCC肿瘤样本的TMB，我们选择了TCGA-HCC队列中由VarScan平台处理的体细胞突变数据
(5)不同LMRGS亚群中TME的综合分析：ESTIMATE、ssGSEA、CIBERSORT
(6)基因富集分析：GSEA
三、实验结果
1.LMRG的鉴定
通过差异基因筛选分析，作者得到了66个差异表达的LMRG，包括3个下调基因和63个上调基因。热图显示了LMRGs在HCC样本和正常样本中的表达（图1A），下调和上调的LMRGs的差异性表达表现在火山图上（图1B）。通过功能富集分析对66个差异表达的LMRG进行了进一步分析。LMRGs的主要生物过程（BP）为参与线粒体基因组维持、线粒体呼吸链复合体组装、电子传递链和代谢过程。对于细胞成分（CC），LMRGs主要存在于线粒体内膜、呼吸链复合体和线粒体呼吸体。LMRGs的分子功能（MF）主要富集在电子传递活性、NADH脱氢酶活性和氧化还原酶活性（图1C）。信号通路分析表明，差异表达的LMRGs与产热、糖尿病性心肌病、氧化磷酸化、非酒精性脂肪肝和活性氧有关（图1D）。上述结果表明，LMRGs主要与代谢过程和氧化反应有关。
图1 HCC中LMRGs的鉴定和富集分析
2.LMRGS的发现与预后意义
为了确定与OS相关的LMRGs，作者进行了单变量的Cox回归分析。共有29个LMRGS与预后有关（图2A）。经过LASSO回归选择后，只有10个LMRGs。然后多变量Cox回归分析构建了LMRGS（图2B,C）。根据LMRGS的系数和参与LMRGS的6个关键基因的表达（包括FKTN，PDSS1，PET117，PUS1，RARS1和RNASEH1）计算了LMRGS得分（图2D）。每个HCC患者的LMRGS得分如下。LMRGS得分=FKTN表达量×0.2496 + PDSS1表达量×0.0881 + PET117表达量×0.0648 + PUS1表达量×0.0567 + RARS1表达量×0.0362 + RNASEH1表达量×0.0928。
图2 LMRG的Cox回归分析和LASSO分析
以LMRGS得分的中位数为界限，将HCC患者分为两个亚组。LMRGS-高组和LMRGS-低组（图3A）。热图显示了两个LMRGS亚组中六个关键基因的不同表达（图3B）。图3C显示了每个HCC患者的LMRGS评分和生存状况。KM分析表明，LMRGS高分的患者的生存期比LMRGS低分的患者有更短（图3D）。如图3E所示，在TCGA队列中，1年、3年和5年的ROC分析的AUC值分别为0.768、0.691和0.666。此外，单变量和多变量回归分析表明，LMRGS评分是OS的独立危险因素。在TCGA队列中，LMRGS评分和临床病理因素的相关性得到了阐明。结果表明，LMRGS评分与病理分级、临床分期、血管侵袭和病毒感染密切相关（图S2）。上述结果表明，LMRGS评分在HCC的进展中起着至关重要的作用。
图3 HCC中LMRGS的预后价值
图S2 LMRGS评分与临床病理因素的关系
3.预测OS的nomogram
为了准确预测OS的概率，作者建立了一个综合LMRGS评分和其他临床病理特征的nomogram，包括年龄、性别和TNM分期（图4A），可以根据总分来估计1年、3年和5年的生存率。校准曲线表明，预测值与实际值高度一致（图4B）。与时间相关的ROC曲线也表明，该nomogram对预测生存率有很高的准确性（图4C）。
图4 nomogram来估计HCC患者的生存率
4.转录因子的调节网络
LMRGs和转录因子之间存在着密切的相互作用。为了探索这种关系，作者进行了共表达分析。如图5A所示，确定了52个差异表达的转录因子与六个重要的LMRG共表达。共表达的转录因子主要功能是染色质重塑和组蛋白修饰（图5B）。KEGG分析显示，这些转录因子主要参与了细胞周期、细胞衰老和Hippo信号传导途径（图5C）。
图 5 转录因子和关键LMRG的共表达
5.与TMB的关联
在TCGA训练集中，作者计算了每个HCC患者的TMB。发现LMRGS高组的TMB较高（图6A，B）。然后对不同LMRGS亚组的突变情况通过瀑布图进行了可视化（图6C）。对于整个数据集，HCC的前10个突变基因是TP53、CTNNB1、TTN、MUC16、ALB、PCLO、APOB、RYR2、MUC4和FLG。错义突变是最常见的体细胞突变类型。在LMRGS高组中，样本的突变频率更高。此外，LMRGS高分的患者有较高的关键基因突变概率，尤其是TP53。随后，进行了KM分析以评估LMRGS评分与TMB结合对生存的影响，结果显示高TMB组的生存时间要比低TMB组短（图6D）。更重要的是，低LMRGS评分和低TMB的患者的OS明显长于高LMRGS评分和高TMB的患者（图6E）。
图6 TCGA训练集中不同LMRGS亚组的肿瘤突变特征
在ICGC验证队列中，还分析了所有样本的突变情况。两个LMRGS亚组之间不存在TMB差异（图S3A,B）。然而，在LMRGS高组，HCC中普遍突变的基因的突变频率更高（图S3C）。LMRGS评分与TMB相结合的生存分析结果与训练队列一致（图S3D,E）。
图S3 ICGC验证集中的肿瘤突变特征
6.不同LMRGS亚组中的TME特征
TME中的基质细胞和免疫细胞对肿瘤的进展、治疗效果和临床结果有深远的影响。图7A所示的热图显示了所有样本的基质得分和免疫活性，发现LMRGS-低组的基质细胞的丰度相对较高。此外，LMRGS-低组的免疫评分比LMRGS-高组高（图7B）。如图7C所示，LMRGS-高组和LMRGS-低组在免疫功能方面存在差异。LMRGS-低组的细胞溶解和IFN反应的活性更高。在LMRGS-高组中，MHCⅠ类的表达较高。
图7 HCC中TME的情况
为了全面分析免疫微环境，用CIBERSORTx计算了22种免疫细胞的浸润程度。图8A显示了TCGA-HCC样本的免疫景观。通过比较免疫细胞谱，发现在LMRGS高组中，滤泡性辅助T细胞（Tfh）、调节性T细胞（Tregs）和M0巨噬细胞明显增加。相反，静息NK细胞、单核细胞、静息肥大细胞和活化的肥大细胞在LMRGS低组中浸润更多（图8B）。
图8 不同LMRGS亚群的免疫细胞浸润特征
除免疫细胞外，进一步探讨了免疫分子与LMRGS评分的相关性，LMRGS评分与免疫检查点的表达呈正相关，包括PD-1、CTLA4、LAG3、TIM3和TIGIT（图9）。
图9 LMRGS评分与免疫检查点的相关性
7.LMRGS的GSEA
为了探索LMRGS所涉及的分子机制，作者采用了GSEA来分析TCGA队列。富集结果显示，DNA修复、E2F靶点、G2M检查点、糖酵解、有丝分裂纺锤体、mTOR信号、MYC靶点和未折叠蛋白反应被LMRGS高组激活（图10A）。此外，LMRGS还参与调控转录因子、DNA修复、细胞周期和代谢相关的信号通路（图10B）。
图10 LMRGS-低组和LMRGS-高组的GSEA
四、结论
本研究构建了一个新的LMRGS，对评估肝细胞癌的预后和反映TME具有较高的价值。其与临床结局密切相关，是一个独立的预后指标。此外，不同LMRGS评分的患者具有不同的TME状态，包括基质细胞和免疫细胞的浸润程度，免疫活性和免疫检查点的表达。因此，LMRGS是一种很有前途的生物标志物，可以预测HCC中的分子和免疫特征，这可能为HCC治疗提供新的治疗策略。
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