Single-cell transcriptomic analysis identifies an immune-prone population in erythroid precursors during human ontogenesis

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摘要：

非免疫细胞在调节免疫功能中发挥着重要的作用，但是红细胞在人类早期发育期间的免疫调节功能仍旧未知。该研究对卵黄囊，胎儿肝脏，早产婴儿的脐带血，正常脐带血和成人骨髓的早期红细胞（有核）进行单细胞转录组测序，鉴定出不同子集和不同分化轨迹的早期红细胞。但是人类胚胎干细胞的体外培养中却没有检测到具有免疫功能的红细胞。具有免疫功能的红细胞比起其他经典的红细胞前体而言，具有红细胞和免疫调节的双重网络，展现出免疫调节功能并且与免疫细胞进行互作。

介绍

人类红细胞发育过程：卵黄囊形成的3-4周即生成原始红细胞（表达胚胎血红蛋白，并且在不剔除的情况下进入循环）→胎儿5-6周其肝脏就会成为红细胞成熟位点→胎儿10-11周其成熟位点会由肝脏转换到骨髓。（血红蛋白也会在这之中发生转变）
除运输氧气之外，有核的CD71+红细胞参与免疫反应

材料方法

YS（yolk sac）:卵黄囊
FL（fetal liver）:胎儿肝脏
UCB（umbilical cord blood）:脐带血
红细胞祖细胞：early: CD34+CD36−CD123−GYPA−; later, CD34−CD36+CD123−GYPA− ；
红细胞前体：GYPAloCD71+ and GYPAhiCD71+
质控标准：基因表达在三个细胞以上，基因表达数大于500，线粒体小于10%。

结果

1. 鉴定具有免疫倾向红细胞的亚群

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首先根据血红蛋白的表达以及气体传输和血红素生物合成过程（GO）正相关水平来定义不同样本来源的红细胞前体数据（比如，HBE1在卵黄囊中，HBG1/HBG2在胎儿肝脏中，成年人脐带血共表达HBG1/HBG2和HBB）。然后在这些处于不同阶段的血红蛋白亚群中提取GYPA+细胞（主要是红细胞前体，包括：红系祖细胞，嗜碱性红细胞，多染性红细胞，嗜酸性红细胞）进行进一步的分析。
GYPA+细胞被分为四个阶段：
C1：信使RNA分解代谢过程，翻译启动和RNA剪接（RPL23, EIF3E and SRSF7）；
C2：激活的细胞循环，核分裂和有丝分裂细胞周期过程的显著富集（MKI67, CDK1 and CDC27）；
C3：比起C1和C2相对成熟；
C4：富集到了免疫活性相关的术语。
C4 标记基因包括SRGN（一种参与炎症反应的肥大细胞和中性粒细胞分泌颗粒的成分），NFKB1A（编码NF-KB）抑制剂的一个成员，控制NF-KB介导的免疫和炎症活动。
红系细胞从C1到C3逐渐成熟，与成熟度（GO：0043249）评分一致。
将有核红细胞分为经典的红细胞簇（C1-C3）和免疫红细胞簇（C4）

2. 不同阶段（YS、FL、UCB）红细胞前体的独特特征

C1：
YS：胆固醇的生物合成和有氧糖酵解等过程；
FL：强烈的蛋白质合成信号；
UCB：更丰富的珠蛋白基因表达。
C2：活跃的细胞分裂特征
YS：
FL：表达量最丰富
UCB：
C3
YS：金属离子稳态相关的基因的高表达
FL：
UCB：
YS红细胞可能作为支持胚胎发育的关键转运体或作为确保向胚胎提供精确供应金属的库存

3.人类胚胎干细胞衍生的红细胞缺乏免疫倾向的细胞

方法：通过IL-3、SCF（干细胞因子）、促红细胞生成素（Epo）,地塞米松诱导胚胎干细胞向红细胞分化。在第14天，吉姆萨染色、球蛋白合成的苯甲胺染色指示，GYPA + CD71 +流式来评估红系细胞。并且收集第4.11,16天的红细胞用于单细胞转录组测序。

诱导不同天数的单细胞转录组图谱.png
第4天分化：hESC C1 （与核糖体生物合成有关）
第11天分化：hESC C2
第16天分化：hESC C3 （氧气传输和气体传输）
体外分化的细胞中并未发现C4免疫类的红细胞，说明体外培养的微环境不利于具有免疫特性的类红细胞的分化。
相关性分析表明，hESC衍生的类红细胞与YS和FL的类红细胞相关性更密切。
其中，hESC中的C1和C3比起YS中的C1和C3表现出更高的细胞凋亡、线粒体自噬和铁死亡。相反，YS中的C1和C3表现则表现出基本的生物学过程（蛋白质折叠、RNA分解代谢过程和线粒体翻译延伸）
hESC衍生类红细胞的过程中会有缺陷，导致未能出现免疫特征

4. 免疫红细胞发挥免疫调节功能

CD71+ 有核红细胞通过细胞相互作用或细胞因子分泌。

免疫细胞激活和细胞因子介导的信号通路在C4中富集.png
表达升高的基因和免疫相关受体表达比较低.png

C4高表达的基因包括：VSIR（encode VISTA）, TGFB1, IL1B, IL7, TNFSF10, 但是与免疫受体活性相关基因在C4细胞中表达普遍较低，表明他们产生免疫信号并传递给其它细胞。

单细胞调控网络推理和聚类（SCENIC）
转录因子：GATA1由所有簇共享，MYC和MYB在红细胞成熟过程中被下调，而KLF1和TAL1依次被激活以促进红细胞终末成熟。此外，C4细胞高度富集 GATA2，MEF2C，SPI1、FOS和JUN等调节子。这些调节子与趋化因子信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性和白细胞跨内皮迁移相关。
CD63在C4中高表达，因此被认为可能是C4细胞的标记，因此分选FL中的GYPA+CD71+CD63+进行单细胞转录组测序。

分选UCB-GYPA+CD71+CD63+与PBMC共培养，并用LPS刺激。定量PCR显示，CD63+细胞比CD63-细胞共培养的炎症相关基因表达更高，另外，在LPS处理后，CD63+细胞比CD63-细胞更高的表达IL-8，IL-6，TNF,MIP-1α，MIP-1β。在CD71+TO+CD63+中也发现了有限的免疫调节能力。

5. 免疫红细胞存在于早产儿的脐带血中

为检测早产儿脐带血（PT-UCB）中是否存在免疫红细胞，分别取32,33,35 WPC(我猜测是怀孕天数)的PT-UCB进行单细胞转录组测序。
结果：免疫特征基因（TGFB1、VSIR和MIF）以及免疫调节基因（GATA、SPI1、JUN、FOS）都出现在PT-UCB当中。
提出问题：早产新生儿为什么比足月新生儿更容易受到感染？
原因：CXCL8，S100A9、MGST3、ANXA1、TNFAIP3在后者中有显著的富集。

6. 免疫红细胞在成人骨髓中持续存在

从七个健康个体中分离出GYPA+ ITGA4+ SLC4A1+/- 红细胞前体进行单细胞转录组测序。

成人骨髓红细胞前体单细胞转录图谱.png
C4中高表达的基因优先与调节功能有关（白细胞黏附、淋巴细胞活化或吞噬作用），另外还包括关键免疫功能基因（TGFB1、VSIR），调节中枢基因（FOS、JUN）和表面标记(CD63)的高表达。
目的：为确定成人骨髓中免疫红细胞的功能
方法：将成人 BM 分离的 GYPA+CD71+ CD63+和 GYPA+ CD71+ CD63-细胞与 CD11b+ PBMC（粒细胞、巨噬细胞）共培养，CD63+刺激的CD11b+细胞中的TNF表达增强。
骨髓红细胞也有免疫调节功能，例如促进促炎细胞因子产生的能力。
不同阶段C4差异.png
结果显示：YS、FL和新生儿UCB阶段的免疫红细胞具有更大的相似性，相反，成年期是更为复杂的存在，总的来说，具有免疫调节功能的免疫前提出现在YS中并持续存在于成人BM中。

7. 免疫红细胞与免疫细胞的作用

CellPhoneDB 揭示潜在的受体-配体，对CD71+红系细胞和其他免疫细胞类型之间的相互作用。
提取YS免疫细胞中的巨噬细胞（之前的数据），另外将GYPA-的FL和UCB细胞的免疫细胞进行单细胞转录组测序，定义巨噬细胞、NK/T细胞、B细胞。最后BM的单细胞转录组数据来源于已发表的文献。

细胞间互作.png

结果：在所有发育阶段，免疫红细胞和免疫细胞之间比经典红细胞与免疫细胞之间具有更强烈的富集和信号强度。在FL、UCB和成人的BM中免疫红细胞可以和多种免疫细胞，但是YS阶段中的红细胞只能和巨噬细胞进行互作。

红细胞与巨噬细胞之间的作用是巨噬细胞清楚衰老或受损的红细胞形成红细胞岛（erythroblastic island，EBI），其中中央巨噬细胞被FL和BM中处于不同分化阶段的成红细胞包围
EBI内经典的红细胞和巨噬细胞之间的相互作用主要是通过整合素（ITGAL/ITGB2 (α1β2) 复合物）、ITGA4/ITGB1 (α4β1)-VCAM1 、ICAM4 或 ICAM2以及EPHB4-EFNB 家族成员。类似的，免疫红细胞中也存在这样的作用。另外，TFRC_TNFSF13B、PGRMC2_CCL4L2 和 CD55_ADGRE5 可能是红细胞与巨噬细胞相互作用的潜在的候选者。
除巨噬细胞外，免疫红细胞与其它免疫细胞相互作用时.......（这里通过一系列实验手段证明免疫类红细胞与各种免疫细胞之间表现出广泛、活跃的相互作用，巩固了它们的免疫调节功能。）

结论

1. 小鼠有核红细胞的免疫调节能力在出生后6-9天达到峰值，随后逐渐下降至第21-28天。然而人类有核红细胞的免疫调节能力出现在YS阶段并能够一直维持到成人BM阶段。另外，该研究进一步指出，有核红细胞有免疫调节亚群而不是整个红细胞前体群，另外，将CD63认为是该亚群的可靠标记，分选出CD63+有核细胞，进行功能验证，通过细胞间通讯分析细胞间相互作用。
2. 免疫红细胞两个转录调节程序的激活：
   ①以GATA1、MYC和MYB调节子为调节中心，以确保正常红细胞的分化。
   ②依赖GATA2，FOS和JUN调节子来指导免疫调节活性