关键词

细菌识别，光热，LDA，

文献信息

"Single-Probe-Based Colorimetric and Photothermal Dual-Mode Identification of Multiple Bacteria"

Anal. Chem. 2023, 95, 3037−3044

https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c05140

中国石油大学（华东）-青岛曾景斌&杨丽敏

摘要

未知样本中多种致病菌的有效鉴定对疾病防控具有重要意义，但仍是一个难题。基于单模阵列的传感方法简单灵敏，但它通常依赖于使用多个交叉反应受体来构建传感器阵列，这是一种繁琐且精度不够的方法。在此，我们开发了一种比色和光热双模式的传感器阵列，用于鉴别多种致病菌。该传感器阵列基于硼酸官能化的Au-Fe3O4纳米颗粒 (BA-GMNPs)，它不仅具有局部表面等离子体共振特性，显示出与AuNPs相似的紫红色，而且还表现出轻度超顺磁性，允许细菌在与纳米颗粒结合之前和之后进行分化。通过共价键将BA-GMNPs固定在细菌细胞表面会减少NaCl诱导的BA-GMNPs的组装。不同的BAGMNPs@bacterial配合物抗组装能力不同，产生不同的比色和光热响应信号。每一种都有独特的分子指纹通过对反应模式的线性判别分析，得到了一种有效的细菌哦研究了六个物种。与基于多受体的单模传感阵列相比，该方法只需要制备单个纳米材料，产生两个信号输出，可更好地鉴别多种细菌。它不仅可以区分多种致病菌，还可以区分革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，更重要的是可以对未知样品进行初步鉴别。

摘要图.

研究背景

食源性致病菌是食品安全问题的主要来源之一。受污染的食物通常含有一种以上的细菌，包括大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌等因此，细菌鉴定，特别是在各种细菌的混合样本中区分不同的细菌种类，是从源头阻止食源性疾病暴发的关键组成部分。嗅觉是我们的基本感官之一，我们能够识别数千种不同的气味。

嗅觉系统的化学特异性不是由于特定分析物的受体，而是由于对数百个嗅觉受体的反应的模式识别。受此启发，开发了一种基于阵列的传感方法来区分多种分析物。在这种方法中，使用多个受体以不同的方式与每个分析物结合，并通过化学计量学方法[例如线性判别分析(LDA)或主成分分析(PCA)]为后续数据处理生成响应信号，最终获得特定于每个分析物的模式识别。获得高维响应数据是准确区分相似分析物的关键。传统的方法是使用多个受体。然而,这通常需要费力的筛选和化学合成。相比之下，它可能更方便用更少的受体开发多模信号。不仅如此，基于多模信号的分析可以避免食物矩阵的干扰，提高精度和灵敏度，显示出相当大的应用前景。

比色传感器是分析测试的强有力的候选者，因为它们允许简单、现场和实时检测，而不需要使用复杂的仪器。贵金属纳米颗粒具有优良的局部表面等离子体共振(LSPR)特性，在比色检测中具有应用优势。大部分的检测原理是基于贵金属纳米颗粒聚集引起的颜色或光谱变化。这些策略具有明显的时间效率和操作简便的优点。例如，Yan等人开发了一种比色传感器阵列。该传感器阵列基于Wulfftype 4-巯基-苯硼酸-巯基乙胺共功能化AgNPs (MPBA-MA@AgNPs) 与细菌的特异性亲和和静电相互作用。然而，我们发现该方法在多种细菌之间的颜色和紫外吸收光谱差异很小。这表明，仅依靠比色信号来区分多种细菌并不理想。Yang等引入光散射、荧光等其他光信号，提高信号维数，快速识别13种含硫物种和硫氧化菌，说明构建多信号传感阵列是可行和必要的。然而，光学信号极易受到样品基质组成的影响，这不利于食品安全分析应用。因此，构建多信号传感阵列的挑战在于寻找合适的新信号。

贵金属纳米粒子还有一种特殊的性质，即光热效应。金属纳米粒子中等离子体振荡的激发引起入射光的强吸收。等离子体纳米粒子吸收的能量可以通过光子的再发射(发光)或通过产生声子(热)来释放。值得注意的是，金属纳米颗粒的光吸收截面大大超过了它们在共振波长的物理截面，赋予它们强大的光热转换能力先前的工作得出结论，等离子体纳米粒子的发光量子产率低于1%；因此，可以认为所有吸收的能都转化为热了与比色法相比，光热法通过准确量化温度变化，提供了一种理想的方法来避免着色真实样品的颜色干扰。

在我们之前的研究中，使用种子介导的方法合成了金/氧化铁(Au-Fe3O4)哑铃状异二聚体。这种异质纳米材料不仅具有LSPR效应和光热效应，而且具有磁性。如果使用Au-Fe3O4纳米颗粒(GMNPs)代替AuNPs进行细菌检测，则可以通过磁分离富集聚集的GMNPs进行光热测量。这可能会进一步增加光热信号。

在这里，我们构建了一个基于比色法和光热检测的双模细菌传感器。如图1所示，将GMNPs与BA功能化，制成非特异性识别探针。高浓度NaCl (2 mol/L)可引起BA-GMNPs的组装。在细菌中，BA-GMNPs会通过共价键与细菌细胞壁中的顺式二羟基结合，从而抵抗由NaCl引起的组装。不同细菌表面顺二羟基的含量不同，导致探针吸附在细菌表面的量不同。因此，不同细菌的抗组装能力不同，磁选后上清液和沉淀物中探针的数量也不同。同样，当细菌混合物中含有不同种类(细菌A + B、细菌A + B+ C)和不同浓度(细菌A + B, A/B = 1:1、1:5等)的细菌时，细菌表面固定探针的总量不同，因此不同细菌混合物对组装的阻力也不同，磁选后上清液和沉淀中探针的总量也不同。提取上清液的RGB值，测量紫外-可见光谱，得到比色信号。当激发光照射析出相时，析出相温度会发生变化，得到光热信号。借助数理统计方法“LDA”，进一步分析传感器对不同细菌的比色和光热响应模式，提取不同细菌响应信号的差异，输出多种细菌的判别标准得分。与基于多维传感器器件的传感阵列相比，该方法只需要制备单个纳米材料，获取两个用于多个细菌识别的信号输出，而不需要额外合成多个传感探针。

图1.

结果与讨论

1.GMNP和BA-GMNP的表征

图2.

2.基于盐诱导组装抑制的原理

BA-AuNPs在高浓度NaCl下容易聚集在细菌存在的情况下，BA-AuNPs通过与细菌细胞壁上的多糖的顺式二醇分子共价结合而固定在细菌表面。由于细菌细胞是微米级的，因此即使在高浓度的NaCl下，固定在细菌表面的BA-AuNPs也不会发生聚集。从而实现对细菌的比色检测。这一原则可能也适用于BA - GMNP。

为了验证这种可能性，在100 μL BA-GMNP溶液中分别加入0、5、10、15、20和30 μL的NaCl (2 mol/L)，然后加入大肠杆菌，使总体积保持在。230 μL，对照组加缓冲液。如图3a所示，加入NaCl后，细菌组和对照组溶液的颜色几乎没有变化，UV-vis光谱的差异最小(图S3a)。虽然细菌组(Ab)和对照组(Ao)的吸光度差值(Ab- Ao)随着NaCl体积的增加而增大(图3a)，但仍不足以进行比色检测 (Ab和Ao分别代表大肠杆菌和对照组存在时上清液的UV-vis最大吸光度)。有趣的是，当细菌组和对照组磁分离5 min时，细菌组上清液的颜色明显比对照组暗(图3b)。紫外-可见光谱显示，当溶液中存在大肠杆菌时，Ab - Ao的吸光度显著高于对照组，在加入15 μL NaCl时，Ab - Ao达到最大值，如图3b和S3b所示。这可能与高浓度NaCl导致BA-GMNPs的组装有关。组装的BA-GMNPs的磁信号增强后，它们更容易被磁选机分离。因此，上清液颜色变浅，紫外-可见吸光度降低。TEM证明了这一推测，如图S4所示，加入NaCl后，BA - GMNPs并不是简单的成团，而是趋于排列，这就是为什么加入NaCl后，溶液的颜色没有明显变化。但是，如上所述，在细菌存在的情况下，BA-GMNPs被固定在细菌表面而不组装。因此，它们不容易被磁性分离，上清液颜色较深。为了验证这一可能的原理，利用透射电镜观察了捕获的BA-GMNPs@E.coli 复合材料。如图S 5a所示，大肠杆菌表面有大量的纳米颗粒结合。利用 HAADF-STEM 和STEM元素图谱对复合材料的组成进行表征，如图S5 c,d所示。可以看出Au和Fe元素被N元素包围。相比之下，当GMNPs表面未经过BA修饰时，大肠杆菌表面几乎没有纳米颗粒，并且纳米颗粒均匀分布在混合溶液中(图S 5b)。

光热检测采用808 nm的近红外(NIR)激发光照射溶液。如图S 3c所示，在不进行磁分离的情况下，细菌组与对照组的温度变化差异不大，辐照100 s后温度达到最高并趋于稳定。从图3 c和S 3d可以看出，随着NaCl添加量的增加，差值(Tb- To)逐渐增大，但Tb - To从未超过1℃ (图3c) (Tb和To表示添加E和不添加E时析出相的最高温度。近红外辐照后分别为大肠杆菌)。但经过磁分离后，析出物的温度在30 s时达到最大值，在808 nm近红外激发光照射下趋于稳定 (图S 3d)。与磁选前溶液中检测相比，不仅检测时间大大缩短，而且可以通过温度变化来区分细菌组和对照组。这可能是因为与细菌组相比，对照组BA-GMNPs更容易组装，从而更容易被磁分离。因此，对照组的降温幅度较高。如图3d所示，当NaCl添加量为15 μL时，To -Tb温度超过30℃，预计这一温差可以进一步区分多种细菌。综上所述，双模信号可用于区分多种致病菌。

图3.

3.识别性能

如图4a所示，磁选后上清液的颜色随着细菌物种。对应的UV-vis光谱见图4b, Ab -Ao见图4c。可以清楚地看到，磁选后Ab减少，但减少程度不同。这可能是由于不同细菌表面所含的顺二羟基含量不同所致。在不同的细菌体系中，磁选后上清液和沉淀中BA-GMNPs的残留量不同。也可以说，不同的细菌对NaCl引起的BA-GMNPs的组装有不同的缓解能力，从Ab-Ao中可以更直观地看出这一点。

同时对磁选后的析出物进行光热检测。如前所述，磁选分离后，不同细菌体系中沉淀中BA-GMNPs的数量不同，因此在808 nm的近红外激发下，样品的最高温度沉淀相(Tb)取决于细菌种类，如图4d所示。析出相在1 min内的温度变化如图4e所示。顺便说一句，这种方法可以区分不同的细菌。为了更好地表示这种分化效应，我们在图中使用了To- Tb。上述结果表明，光热试验和比色试验可以相互印证，可有效区分6种致病菌。

图4.

对比色和光热模式用LDA分析，对每种细菌的每种模式进行5次测试，生成训练矩阵(5个信号× 6个细菌× 5个重复) (表S1)。然后用SPSS (version 22.0)分析软件对矩阵进行处理。总方差有三个典型因素(97.9,2和0.1%)。使用前两个最重要的鉴别因子 (图5 a)生成2D图，其中每个点代表BA - GMNPs对一种细菌的双峰反应。6种细菌被清晰地划分为6个簇，没有重叠，证明了基于BA - GMNPs的传感器对细菌的有效识别。值得注意的是，无菌菌、革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌分布在不同的区域，这意味着我们的传感器不仅可以确定细菌的存在或不存在，而且还具有区分不同类型细菌的潜力。这种辨别能力归因于双峰信号的使用。如图S 6所示，当仅使用比色模式时，LDA无法实现上述的鉴别，这表明双模检测方法可以提高鉴别精度。

此外，使用层次聚类分析(HCA)来探索所提出的传感器揭示不同种类细菌之间相似性的能力。HCA根据它们的欧几里得距离根据它们的相似性逐步分类分析物如图5 b所示，使用平均链法从HCA生成的树状图清楚地显示了六个不同的分支，每个分支对应一种细菌。根据树状图，首先将6种细菌分为两大类，金黄色葡萄球菌和单核增生李斯特菌为一类，即革兰氏阳性：大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌。而铜绿假单胞菌为另一类，即革兰氏阴性菌。在革兰氏阴性细菌中，鼠伤寒沙门氏菌，E. sakazakii和P. aeruginosa的匹配度最高，表明其成员更相似。这也验证了图5 a中细菌的分布。为了检验该方法的重现性，制备了5批GMNPs并用于试验。结果令人满意，并在补充信息中给出了详细的讨论 (图S7-S11)。

图5.

4.区分细菌混合物

细菌混合物的分化。为了进一步研究所提出的基于BA - GMNPs的传感器识别细菌混合物的能力，我们将两种细菌以不同的比例(1:0、1:1、1:5、1:10 和 0:1) 混合并识别它们。典型的评分图清楚地显示。如图6 a、b所示，不同比例的大肠杆菌、单增李斯特菌、鼠伤寒李斯特菌、单增李斯特菌可以很好地分离，没有重叠。在其他细菌的混合物中存在部分重叠(图S12)，这将在今后的工作中得到改进。然后对3种细菌 (A + B + C) 和2种细菌 (A + B) 的混合物进行检测和分化，如图6 c所示。但仅采用比色单模型无法实现上述分化，如图S13所示，不同比例的混合菌部分重叠。因此，本文提出的基于BAGMNPs的双模传感器具有良好的混合细菌识别能力。

图6.

5.传感阵列的实际应用

传感器阵列的实际应用。为了验证所构建的传感器的有效性和实用性，在盲实验中使用了15种先前识别的病原体。使用之前实现的四张LDA分布图将15个未知样本作为模板进行判别分析，得到4个模板中每个未知样本的预测分组和预测概率，结合4个预测概率得到该未知样本的最终预测分组如表1所示。

将6种致病菌以OD 600 = 0.1的浓度加入牛奶样品中。如图6 d和S 14所示，这些致病菌可以被成功地分为六类。与磷酸盐缓冲液中获得的典型评分图相比，致病菌在牛奶中的相对位置几乎没有变化。这些结果表明该传感器具有良好的抗干扰能力，可以进行真实的生物样品分析。

表1.

研究结论

综上所述，建立了基于BA-GMNPs的多种细菌的比色-光热双模式鉴定方法。在高NaCl浓度下，BA-GMNPs不像AuNPs那样简单聚集，而是倾向于以一种排列方式聚集。在细菌存在的情况下，BA-GMNPs通过共价键与细菌细胞壁上多糖的顺二醇部分结合，从而抑制NaCl诱导的组装。磁选后，上清液提供比色信号，沉淀物提供光热信号。由此形成了双信号传感器阵列,据我们所知，这种多模态传感阵列很少被报道。在LDA的帮助下，对6种细菌进行了有效的鉴别，此外，该传感器阵列可以对未知样品进行初步鉴别，对牛奶等真实样品中的细菌识别有效。我们提出的传感器提供了一种简单有效的细菌识别新策略，并可扩展到其他生物医学分析。