本节继续就MALDI成像质谱工作流程中的蛋白质提取策略进行整理。
MALDI成像质谱法化学衍生化蛋白提取
化学衍生化对存在于组织表面的分析物进行修饰，以增强靶标蛋白的分析特性，如灵敏度和碎片效率等。化学衍生化法可应用于小分子分析物的研究，以提高具有低电离效率的物质的敏感性。有许多研究已经使用蛋白质的化学衍生法简化从自下而上的MALDI数据集生成的片段化数据。如在MALDI TOF/TOF实验过程中的N末端衍生化方法，几乎只产生y型序列离子。N末端衍生化是通过使用磺化剂3-磺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯（3-SBASE）将负电荷添加到胰蛋白酶肽的N末端，该磺化剂使MALDI生成的离子生成完整的y片段。在使用福尔马林固定，石蜡包埋的组织中，N-聚糖MALDI IMS可使用唾液酸衍生方法，为了保留唾液酸基团（通常在离子化和离子转移过程中因源衰变而丢失），唾液酸衍生法使用键特异性脱甲基和酰胺化来稳定衰变的离子。与原位酶消化相似，这些方法可直接从组织中进行蛋白质谱鉴定，但因为产能受限，更适合于在靶向研究中使用。
MALDI成像质谱法液体微萃取表面分析蛋白提取
液体微萃取通常称为液体萃取表面分析（LESA），利用少量的可以放置在样品表面的萃取溶剂（$ 0.5-3μL）进行。组织中存在的分析物扩散到溶剂中，随后溶剂从组织中析出，并进行检测分析，LESA技术可实现包括小分子代谢物到完整蛋白的各种物质的分析。LESA最初的研发集中于自动化操作的实现，利用连续流动的液体微结在分析后自动建模，新的方法使液体提取直接与在线LC-MS/MS结合起来。通过空间定向提取，然后采用自上而下的LC-MS/MS，可以使蛋白质谱鉴定与IMS数据中得到的物种直接关联起来。LESA分析法的一个挑战是组织上液滴直径的大小，通常，LESA的日常使用空间分辨率限制为~500μm。虽然自动化LESA平台可以进行可靠可重复的分析，但使用手动移液器进行液体微萃取也可以产生高质量的蛋白质组学数据。通过移液器手动将1-2μL萃取溶剂滴在组织上的方式，吸出溶剂后将其脱机进行自上而下的LC-MS检测，从薄组织切片中能检测出多达100种完整蛋白质物种。尽管分辨率有限，LESA提供了一种从组织中收集空间定位蛋白质鉴定的高通量方法。
图四：LESA的灵敏度及应用：（a）从酶消化后的大鼠脑中提取样品，评估独特蛋白质鉴定的数量与溶剂提取量的关系。（b）从小鼠幼仔整个切片的选定区域收集完整的蛋白质提取物。自上而下质谱法进行蛋白鉴定，通过精确的质量匹配将其与IMS数据相关联。展示了胸腺素B10的ETD谱图及其相应的离子覆盖情况。
本文由北京百泰派克生物科技编辑整理，资料来源：
Ryan, 2019, Protein identification strategies in MALDI imaging mass spectrometry: a brief review
北京百泰派克生物科技有限公司从事蛋白质理化性质分析及结构解析、以质谱技术为基础的蛋白质组学代谢组学技术服务。公司致力于建立国际领先的蛋白质研究分析技术平台，为各科研院所和大学提供高效、准确、性价比高的蛋白质（组）研究技术包裹，协助客户在基础研究、分子诊断及其他生命科学研究领域取得突破，为生命科学的发展做出贡献。
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