Multi-Omics Analysis of the Therapeutic Value of MAL2 Based on Data Mining in Human Cancers
基于人类癌症数据挖掘的 MAL2 治疗价值的多组学分析
发表期刊： Front Cell Dev Biol
发表日期：2022 Jan 17
doi:10.3389/fcell.2021.736649
期刊相关信息
一、背景
研究报道，T 细胞分化蛋白 2 (MAL2) 是癌症中的重要调节因子。MAL2 蛋白在多种上皮细胞、外周神经元、肥大细胞和树突状细胞中表达，在免疫、肿瘤发展和其他生理和病理过程中至关重要。最新研究表明，在乳腺癌组织和细胞中可以检测到MAL2的高表达并且MAL2参与调节细胞增殖、侵袭和转移；促进癌症的恶性进展；并且与临床病理学或预后显著相关。MAL2高表达患者的预后比低表达患者差。
MAL2可能是乳腺癌的潜在治疗靶点和预后因素。然而，并没有系统的研究分析 MAL2 在人类癌症中的作用。在目前的研究中，观察到MAL2与卵巢癌（OC）患者的生存率和基因突变率之间存在强烈的相关性。
二、材料与方法
1.数据来源
（1）基于公共数据库：TCGA、GTEx、GEO等的13种癌症相关信息
（2）人类OC细胞系HO8910和OVCAR3以及人卵巢上皮细胞系IOSE80和293T
2.分析流程
（1）表达分析与临床相关性分析：GEPIA；Kaplan–Meier plotter
（2）突变和甲基化分析：COSMIC；cBioPortal；UCSCXena工具用于分析Illumina的人类甲基化与OC患者基因表达之间的相关性
（3）功能丰富与PPI、GGI网络建设：Metascape是在MAL2和相邻基因之间进行GO和KEGG富集分析的强大工具；STRING用于分析PPI；GeneMANIA用于通过构建交互网络来获取与MAL2相关功能的相关基因列表，以澄清MAL2与其交互基因之间的关系
（4）肿瘤途径与药物敏感性分析：GSCALite被用来分析MAL2及其邻近基因在激活癌症途径和进行药物敏感性方面的影响
（5）细胞培养和转染、CRISPR/Cas9与慢病毒转染、RNA提取和实时定量聚合酶链反应、蛋白质印迹、细胞计数试剂盒-8分析、菌落形成试验、细胞凋亡测定、Transwell分析、伤口愈合试验
（6）OVCAR3卵巢癌异种移植模型中的肿瘤生长：小鼠实验
三、实验结果
1.MAL2表达的泛癌分析及其预后价值
首先，通过使用GEPIA数据库比较TCGA中泛癌组织和癌旁组织的转录组数据，确认了MAL2在多种癌症组织中的表达情况。数据显示MAL2在泛癌中高度表达，包括膀胱尿路上皮癌（BLCA）、浸润性乳腺癌（BRCA）、宫颈鳞状细胞癌（CESC）、肺腺癌（LUAD）、肺鳞状细胞癌（LUSC）、OC、胰腺癌（PAAD）、直肠腺癌（READ）、胃腺癌（STAD）、胸腺瘤（胸腺），和子宫体子宫内膜癌（UCEC），并且在两种癌症类型中显著上调，涉及OC和UCEC（图1A）。综上所述，MAL2在不同类型的癌症中都处于过表达状态，表明MAL2可能是上述癌症类型中致癌的潜在关键调节因子。接下来，使用KM生存曲线检测MAL2在泛癌中的预后价值（图1B–L）。总之，MAL2可能被用作OC患者的潜在治疗靶点和不良预后生物标志物。
图1 MAL2在多种癌症中的表达分析和总生存期（OS）分析
2.人类癌症中的 MAL2 突变情况
从COSMIC和cBioPortal中挖掘泛癌的MAL2突变数据。这些数据提供了关于不同类型突变的信息，包括无义突变、错义突变和同义突变。如图2所示，错义突变在乳腺组织（2.17%）、大肠（18.52%）、肺组织（50%）、卵巢组织（13.99%）、胰腺组织（2.7%）、胃组织（50%）和子宫内膜组织（30%）中很明显，而协同突变和无义突变很少见，仅在总样本中的少数样本中发现。突变样本大多位于OC，MAL2编码链中最常见的突变为C>T（41.25%）和G>A（31.25%）。
图2 泛癌中MAL2在不同体细胞中的突变
图3A-C显示了基于TCGA数据库的cBioPortal数据，MAL2中有18个突变位点，位于氨基酸0和176之间（图3C）。卵巢浆液性囊腺癌和浸润性乳腺癌的突变率较高（图3A）。拷贝数改变是另一种突变，最常见的拷贝数改变是增益和扩增（图3B）。作者研究了OC样本中MAL2启动子区域的DNA甲基化。数据显示，OC组织样本中存在广泛的MAL2基因低甲基化，这与MAL2在OC中的高表达一致，表明MAL2的启动子低甲基化可能是MAL2高表达的机制（图3D）。这些结果可能有助于进一步了解MAL2在OC中的作用机制。
图3 泛癌中 MAL2 的改变
3.OC 患者MAL2的功能富集和 PPI 网络
通过STRING构建MAL2的PPI网络，探索了MAL2的功能及其与蛋白质的相互作用。PPI网络图包含MAL2和10个相关蛋白，包括TPD52、TPD52L2、PIGR、CD59、OCLN、FRMD4B、STK16、SH3YL1、A2ML1和YIF1A（图4A）。根据GTEx（n=88）和TCGA（n=427）的数据，进一步研究了10个hub基因的表达。如图4C所示，OC组织中的TPD52、TPD52L2、PIGR、OCLN、FRMD4B、STK16、A2ML1和YIF1A表达水平显著升高，而OC中的SH3YL1表达显著降低（p<0.05）。最后，为了评估检测 OC 患者的 10 个hub基因的特异性，获取mRNA表达数据构建了ROC曲线。在这些曲线中，TPD52、OCLN和YIF1A在OC中的AUC得分最高，其次是FRMD4B、STK16和PIGR，而其他基因（TPD52L2、SH3YL1、A2ML1和CD59）的检测准确度在0.547到0.646之间（图4B）。
图4 OC 患者中 MAL2 的功能富集和蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI) 网络
4.OC中MAL2的GGI网络和药物敏感性
作者从生物信息学的角度进一步探究了MAL2在OC中的作用机制。使用Metascape数据库中的GO分析预测MAL2和显著相关基因的功能。GO富集分析显示，MAL2主要参与钙粘蛋白结合，钙粘蛋白结合参与细胞-细胞粘附、表皮发育等（图5A）。
随后，使用GSCALite在线工具分析了MAL2在OC药物敏感性中的潜在作用。用GeneMANIA构建MAL2和20个突变最严重的相关基因的GGI网络。GGI网络显示MAL2与TPD52密切相关，而TPD52曾被报道是MAL2的分子伴侣。在这些基因中，CDH1与MAL2改变密切相关（图5B）。
图5 OC 中 TPD52、CDH1 和 MAL2 的基因-基因相互作用（GGI）和药物敏感性
为了进一步了解MAL2的临床意义，从GGI网络中选择了前三个hub基因（MAL2、CDH1和TPD52），用CTRP分析它们在OC药物敏感性中的潜在作用。结果表明，CDH1的高表达对51种药物或小分子具有抗性，MAL2 的高表达也对 52 种药物或小分子具有抗性，表明MAL2在OC中具有潜在的介导药物敏感性的能力（图5C）。
5.OC 细胞系中的 MAL2 表达
为了验证数据挖掘获得的结果，采用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白质印迹法检测了OC细胞系HO8910和OVCAR3以及人卵巢上皮永生化细胞系IOSE80中MAL2的表达。如图 6A、B所示，OC细胞系OVCAR3和HO8910中MAL2表达水平高于正常卵巢上皮细胞系IOSE80；因此，选择OVCAR3和HO8910进行后续实验。为了研究 MAL2 在 OC 中的潜在作用，作者使用 CRISPR/Cas9 敲除 MAL2。研究设计了两个MAL2 -靶向 sgRNA直接针对 MAL2 exon 1 的。将重组载体包装成慢病毒，然后用于感染OC细胞。为了确定敲低效率，使用 qRT-PCR 来确定 MAL2 的 mRNA 表达水平（图 6C）。然后，蛋白质印迹证实这些单克隆细胞系中MAL2的蛋白表达被敲除（图 6D）。主要展示KO-2组的实验结果，为了方便后在文中用KO来表示KO-2。
图6 MAL2 在 OC 细胞系中的表达
6.敲除MAL2抑制体内外OC细胞的增殖并促进细胞凋亡，抑制OC细胞的迁移和侵袭
由于增殖和凋亡是癌症的两个关键标志，作者进行了CCK-8和菌落形成实验以评估MAL2表达对细胞增殖的影响。与阴性对照（NC）细胞相比，MAL2敲除细胞的吸光度值和菌落数显著降低（图7A，B）。在异种移植小鼠中，敲除MAL2可明显抑制肿瘤生长（图7C）。体内实验结果进一步证实，敲除MAL2可有效抑制OC细胞的增殖。为了研究敲除MAL2是否能增加卵巢癌细胞的凋亡率，通过荧光显微镜观察细胞凋亡，结果显示MAL2抑制凋亡（图7D）。研究进一步进行了Annexin V和PI双染法的流式细胞仪分析，以检测卵巢癌的细胞凋亡率。 在MAL2敲除组中，总凋亡细胞显著增加（图7E）。这些结果表明，MAL2可以促进OC细胞增殖和凋亡。
图7 敲除OC细胞中的 MAL2 可抑制增殖和凋亡
转移是OS的一个重要特征，导致患者预后不良。为了研究MAL2对OC细胞迁移和侵袭的影响，在体外进行了Transwell实验和伤口愈合实验。如图8A，B所示，MAL2的下调抑制了OC细胞的迁移和侵袭。EMT在将上皮细胞转化为具有更具侵袭性表型的间充质细胞方面起着至关重要的作用，这与肿瘤细胞的侵袭和转移有关，EMT相关蛋白标记物在此过程中失调，例如，N-钙粘蛋白和波形蛋白上调，E-钙粘蛋白下调。有趣的是，作者观察到MAL2基因敲除增加了E-钙粘蛋白的表达，而降低了N-钙粘蛋白和波形蛋白的表达（图8C，D）。总之，这些结果表明，MAL2基因敲除抑制OC中的EMT过程，这可能是OC中细胞转移和侵袭的潜在机制。
图8 敲除 OC 细胞中的 MAL2 可抑制迁移、侵袭和上皮间质转化 (EMT)
四、结论
研究分析了泛癌中 MAL2 的表达、存活率和突变数据，揭示了 MAL2 在多种癌症中的潜在作用。然后重点对OC中MAL2甲基化、功能富集、PPI和GGI网络、癌症通路和药物敏感性进行数据挖掘，表明MAL2可能是OC的潜在药物靶点。为了进一步验证来自数据库的数据，获得了重要的表型结果，并证明 MAL2的下调表达与OC细胞的增殖、迁移和EMT过程相关。
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