自SARS-CoV-2爆发以来，针对病毒感染和疫苗接种引起的免疫应答机制的研究出现井喷式增长。然而，目前的研究主要关注转录组、蛋白质组和代谢组的变化，关于表观基因组，尤其是单细胞水平的变化仍属于待开发领域。在本文中，研究者使用包括单细胞ATAC测序、单细胞转录组测序等单细胞多组学技术综合分析了流感疫苗接种后引起的表观基因组变化，为流感疫苗作用的机制提供了新的见解。
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文章题目：The single-cell epigenomic and transcriptional landscape of immunity to influenza vaccination.
中文题目：流感疫苗免疫的单细胞表观基因组和转录组图谱
发表时间：2021.07
期刊名称：Cell
影响因子：41.581
实验平台：10x Genomics Chromium（scATAC-seq & scRNA-seq）、EpiTOF
DOI：10.1016/j.cell.2021.05.039
研究背景
近期的研究表明表观基因组在调节生物过程中起核心作用，并能在很长时间内保持特定的染色质状态。在免疫系统背景下，已研究过造血过程、免疫记忆产生、T淋巴细胞衰竭等过程中的表观遗传事件。而在疫苗接种领域，对卡介苗的研究指出接种该疫苗可诱导单核细胞中表观基因组变化，并能导致固有免疫系统的持续性激活状态。然而，这种影响是否普遍存在于其他疫苗，或者疫苗、佐剂的类型与微生物组对表观组的影响尚未可知。尽管前人研究中已发现单核细胞和树突状细胞在转录组与蛋白组水平上存在异质性，但细胞异质性在疫苗免疫期间如何影响表观基因组完全未知，缺少对免疫反应期间人类表观基因组状态的系统性分析，尤其是在单细胞水平上。因此在本文中，研究者使用了多种单细胞技术，包括EpiTOF、scATAC-seq和scRNA-seq技术构建人类对季节性和大流行性流感疫苗接种免疫的表观基因组和转录组图谱，分析染色质可及性和基因表达的差异。
研究内容
TIV接种后免疫细胞的表观基因组重编程
研究者首先使用EpiTOF（epigenetic landscape profiling using cytometry by time-of-flight）技术分析了21名年龄在18-45岁的健康个体在注射三价灭活季节性流感疫苗（TIV）前后的表观基因组变化。所有受试者在第0天接种TIV。为了确定肠道微生物对表观免疫细胞的影响，10名受试者在-3天到第1天之间额外接受一种口服抗生素方案，包括新霉素、万古霉素和甲硝唑。对不同时间点（接种前21、0天和接种后1、7、30和180天）PBMC的EpiTOF结果分析表明，一些受试者的髓样细胞比例在较晚时间点有降低趋势，而浆细胞样树突状细胞(pDCs)比例在抗生素治疗(第0天、第1天)的反应中有瞬时增加的趋势。利用组蛋白修饰信息绘制表观免疫细胞的UMAP图谱并发现淋巴样细胞从髓样细胞中分离出来，而造血祖细胞(CD34+)表现出不同于完全分化免疫细胞的独特表观遗传模式。第30天与第0天样品点分离，说明TIV诱导表观组改变。此外，几种组蛋白标记在接种疫苗后的修饰状态改变，但与是否使用抗生素无关。
髓样细胞中持续性表观基因组重编程
免疫后第30天，经典单核细胞和髓样树突状细胞(mDCs)表现为H2BK5ac、H3K9ac、H3K27ac、H4K5ac和PADI4被抑制。其中，PADI4与单核细胞发育和炎症相关，与乙酰化标记具有高度相关性。四种组蛋白乙酰化标记和PADI4随时间降低，在第30天最低，而在第180天基本恢复到基线水平。血液转录组分析表明，组蛋白乙酰转移酶CREBBP/CBP和KAT6A在接种后第1、3和7天下调，而各种组蛋白脱乙酰酶的表达增加。此外，赖氨酸甲基转移酶EZH2的表达增加，这与H3K27ac的拮抗物H3K27me3的表达增加一致。因此，表观基因组和转录分析都表明，在TIV免疫后，髓样细胞处于潜在的低乙酰化状态。
接下来，利用组蛋白修饰标记和PADI4表达特征对经典单核细胞和mDCs进行亚聚类分析表明，第0天和第1天的细胞与第30天的细胞在2D空间上分开位于两侧，180天的细胞处于中间状态，说明持续的表观改变可以TIV免疫6个月后检测到。
Fig.1 TIV 改变免疫细胞的整体组蛋白修饰谱
TIV诱导天然免疫细胞持续性功能改变
为了确定髓样细胞表观遗传学变化对功能的影响，研究者在接种前后不同时间点用模拟细菌的人工合成Toll样受体(TLR)配体或病毒病原体相关分子刺激PBMCs。刺激24h后，接种后30天的PBMCs中一些细胞因子（TNF-α、IL-12、CXCL5/10和GCSF等）显著下降。与表观基因组变化相似，减少的细胞因子在1-7天变化明显，30天最低，180天恢复到接近基线水平。所有这些细胞因子都被TLR混合物强烈诱导，且无论是抗生素处理组或对照组，其含量都低于第0天水平。将TLR诱导细胞因子与组蛋白修饰水平进行关联分析发现，组蛋白乙酰化标记，H3K27ac和PADI4，与细胞因子产生呈正相关。相反，H2BS14ph和几个抑制甲基化的标记，包括H3K27me3和H4K20me3与细胞因子产生呈负相关。
TIV诱导髓样细胞AP-1靶点染色质可及性降低
研究者分选富集天然免疫细胞并进行bulk ATAC 分析免疫前后染色质可及性变化。与第0天相比，第30天CD14+单核细胞中检测到10000多个差异可及区（DAR），mDC 约4500个，而pDC仅有微小差异，这些区域中大多数可及性降低，表明基因活性下降。CD14+单核细胞免疫诱导的前200个DAR中，许多免疫相关基因包括几种细胞因子和趋化因子及其相关受体（IL-18、CXCL8等）、病原识别受体和粘附分子可及性下降。这些减少的DAR主要位于非启动子区，表明远端调控元件如增强子参与其中。接下来，为了确定调控模式研究者确认DARs是否富集了转录因子（TF）结合motifs。在单核细胞和mDC的DAR中富集了AP-1家族的bZIP 转录因子，且携带这种motif的DAR在接种后染色质可及性下降，特别是非启动子区。与组蛋白乙酰化类似，AP-1 转录因子表达在接种后第7天首次检测到减少，第28天最为明显。
为研究表观和转录水平的异质性，研究者利用单细胞ATAC和单细胞转录组测序技术分析从PBMC中富集到的DC细胞，并从62101个细胞中获得了染色质可及性数据，生成了固有免疫系统的表观基因图谱，识别到了主要的固有免疫细胞类型，包括经典与非经典单核细胞、mDC和pDC。单细胞转录组分析得到34368个细胞数据。在经典单核细胞和mDC中，AP-1的可及性在接种后30天显著降低，且这种降低在接种后第一天就开始了，说明TIV诱导的表观基因组重编程在疫苗应答的急性阶段就已出现。接下来，研究者对经典单核细胞进行亚亚群分析并根据不同的时间模式分为了四个细胞群体。第0天的优势细胞群（cluster6和cluster8）AP-1可及性高，而在cluster5（第30天的优势细胞群）中可及性低，cluster3表现出中等水平的AP-1和CEBP可及性且在整个免疫接种过程中保持稳定。异质性下游区富集了与产生致炎相关因子、TLR信号和AP-1部分成员相关的区域，AP-1可及性高的细胞在炎症基因编码区也显示出高可及性。最后，单细胞转录组分析发现上述富集基因的表达异质性小于可及性异质性。
Fig.2 单核细胞群体内的异质性驱动TIV诱导表观基因组改变
AS03佐剂的H5N1流感疫苗诱导髓样细胞AP-1位点染色质可及性降低
研究者将灭活的季节性流感疫苗研究结果与前人对卡介苗减毒活疫苗的研究进行比较，并猜测活的卡介苗传递了强力的佐剂信号，刺激髓样细胞持续的表观基因组变化，而季节性流感疫苗由于没有佐剂，无法得到训练好的免疫力，而是获得了训练好的耐受性。因此，研究者假设在灭活的流感疫苗中添加佐剂会引起增强且持久的固有反应，并使用AS03佐剂来进行研究。在一组接种了H5N1流感灭活疫苗+AS03或只接种疫苗的健康人中（9v9），利用EpiTOF分析第0、7、21、28和42天的PBMC样品构建组蛋白修饰图谱。比较第0和第42天的组蛋白修饰情况发现加入AS03后经典单核细胞中H3K27ac、H4K5ac、H3K9ac和PADI4的表达显著减少，且大多数在TIV接种后显著减少的固有细胞因子和趋化因子在加入AS03后也减少。
接下来，从4例PBMC样品中富集DC细胞（2例H5N1+AS03和2例H5N1，时间点第0、21、42天）并使用单细胞转录组+单细胞ATAC分析，获得了58204个细胞的可及性信息和11213个细胞的基因表达信息。结果表明H5N1+AS03中AP-1的可及性显著降低。与接种TIV后相似，多个AP-1家族成员包括c-Fos和c-Jun的表达量减少。
Fig.3 H5N1+AS03诱导类似TIV的抑制性表观基因组状态
AS03佐剂H5N1流感疫苗诱导抗病毒反应位点染色质可及性增强
尽管AP-１可及性下降，但H5N1+AS03处理组中干扰素反应因子（IRF）和STAT家族中，与第0天相比，第42天染色质可及性增加，且这些改变在接种后第21天就已出现。在转录水平，IRF1和STAT1在多个固有免疫细胞亚群中的表达显著增加。IRF可及性与AP-1可及性一般呈负相关，尤其在树突状细胞中，而包含IRF1结合序列的peaks可及性多数显著提高。在可及性提高的基因中，鉴定到了许多干扰素和抗病毒相关基因，包括DDX58、IRF1/8等。总之，只有接种H5N1+AS03疫苗，而不是单独接种H5N1或TIV，才能全面提高抗病毒反应位点的可及性。接下来，为确认在静息单核细胞中表观基因组的变化是否转化为基因表达的变化，研究者评估携带IRF1 motifs的显著变化peaks的可及性与同一基因表达水平之间的关系。结果表明，抗病毒和干扰素相关基因在每次接种疫苗后的第 1 天上调，尤其是在接种 H5N1+AS03 的组中，而且接受加强疫苗接种的受试者表现出更高的抗病毒基因表达水平，由于加强疫苗是在固有免疫系统染色质可及性发生改变时接种的，说明IRF 基因座的可及性增加可能增强对加强疫苗的反应。
为了确定观察到的表观基因组变化是否能增强对病毒感染的抵抗力，研究者用登革热或寨卡病毒对第0、21和42天的PBMC样品进行体外感染实验，并在感染后第0、24和48h确认病毒拷贝数，发现接种疫苗后第21天登革热和寨卡病毒的病毒滴度显著降低，两种病毒诱导IFNa和IFNg的产生，但登革热病毒抑制了IP10的产生。将第0和21天的病毒滴度与疫苗诱导的开放染色质相关的抗病毒基因表达变化联合分析表明，这些基因中大多数与病毒滴度呈负相关。此外，IRF1基因与两种病毒均呈显著负相关，参与这两种病毒感染免疫的抗病毒基因ANKRD22也呈高度负相关。
Fig.4 H5N1+AS03诱导抗病毒免疫增强的表观基因组状态
主要结论
研究者在单细胞水平绘制了人类接种流感疫苗后表观基因组和转录组的免疫图谱。研究表明，季节性流感疫苗诱导单核细胞和mDCs中的H3K27ac持续减少，这与对Toll样受体刺激的细胞因子受损反应有关。单细胞ATAC测序结果揭示了一种表观上独特的单核细胞亚群，在疫苗接种后，AP-1靶向位点的染色质可及性减少。在接种AS03佐剂的H5N1大流行性流感疫苗的反应中也观察到了类似的效果。然而，该疫苗也刺激单核细胞和mDC中干扰素反应因子(IRF)位点染色质可及性持续增加。这与抗病毒基因的表达升高以及对无关的寨卡和登革热病毒的抵抗力增强有关。这些结果表明，疫苗接种刺激了固有免疫系统持续的表观基因组重塑，并揭示了AS03作为表观遗传佐剂的潜力。
参考文献
Wimmers, Florian et al. “The single-cell epigenomic and transcriptional landscape of immunity to influenza vaccination.” Cell vol. 184,15 (2021): 3915-3935.e21.
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