引言
mRNA 3’末端加工是基因表达中必不可少的一步。经典的真核生物前体mRNA 3’加工是在由数十种反式作用蛋白组成的大分子机器内进行的。然而，RNA在这个过程中是否起作用目前还不清楚。本文作者发现小核仁RNA（snoRNA）的一个新功能，即在mRNA 3’加工过程中起作用。
摘要：mRNA 3’末端加工是基因表达中必不可少的一步。经典的真核生物前体mRNA 3’加工是在由数十种反式作用蛋白组成的大分子机器内进行的。然而，RNA在这个过程中是否起作用目前还不清楚。本文作者发现小核仁RNA（snoRNA）的一个子集与哺乳动物mRNA 3’加工相关。这些snoRNA主要与Fip1（裂解和聚腺苷酸化特异性因子（CPSF）的一个组分）相互作用。作者对这些snoRNA中的一种进行了功能性鉴定，研究结果表明，U/A丰富的SNORD50A通过阻断Fip1-poly（A）位点（PAS）的相互作用抑制mRNA3’末端的加工。SNORD50A消耗改变了Fip1-RNA相互作用的格局并且改变了可变聚腺苷酸化（APA）概况。
本文揭示了snoRNA的一种新功能，并提供了第一个证据，即非编码RNAs可能在调控mRNA 3’末端的加工中发挥重要作用。
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1、SnoRNA的一个子集与mRNA 3’末端加工的复合体有结合
本文作者使用一种常用的用于体外mRNA 3’端加工测定的PAS RNA底物(SVL) PAS做为mRNA研究对象。作者首先用(SVL) PAS作为探针进行RNA pull-down实验，(SVL) PAS的点突变探针作为阴性对照，获得了与之结合的蛋白及RNA。将获得结合的RNA进行高通量测序发现一些特异的snoRNA被富集下来
然后作者将pull-down的产物RNA进行northern blot验证证明了测序数据的可靠性（下图C），表明了四种snoRNA（SNORD50A、SNORA5A、SNORD102、SNORD22）与(SVL) PAS的关联性；另外，作者将pull-down获得的蛋白进行WB检测已知的3’末端加工因子Wdr33, CPSF30, CPSF160,CstF64, CstF64发现它们与(SVL) PAS具有关联性（下图B）。
已知snoRNA与几种特异性蛋白质配体组装成经典的RNP，于是作者又将pull-down获得的蛋白进行WB检测组成RNP的核心蛋白如dyskerin, NOP58和fbrillarin发现它们与(SVL) PAS不具有相关性（下图B）。说明包含有snoRNA的Mrna 3’末端加工复合体并没有形成经典的RNP。
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2、SNORD50A调节mRNA 的3’末端加工
上面的结果说明了一些snoRNA是mRNA 3’端加工复合体的组成部分，那么这些复合体中的snoRNA是否对mRNA的3’端加工其作用呢？作者将复合体中富集最多的SNORD50A作为研究的焦点。
作者首先通过体外实验检测SNORD50A对SVL PAS的3’端加工的影响，以不在复合体中富集的SNORA78作为阴性对照，结果表明随着SNORD50A的增加SVL PAS的poly(A)形成减少（下图A）。说明SNORD50A能在体外抑制SVL PAS的3’端加工。
后作者在细胞体内对SNORD50A进行过表达和敲低处理后检测SVL PAS的活性，结果表明SNORD50A过表达后SVL PAS的活性明显降低（下图B），而敲低后SVLPAS的活性明显升高。说明SNORD50A能在体内抑制SVLPAS的3’端加工（下图C、D）。
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另外，作者又检测了SNORD50A敲低细胞中的其他Asns、Egr1和Ptch2基因mRNA的表达情况和PAS活性，结果表明SNORD50A敲低后这些基因的初始转录本不受影响而成熟的mRNA含量明显增加了（下左图），PAS活性也明显增强（下右图）。说明SNORD50A调节一些内源性mRNA的加工。
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3、snoRNA通过阻断Fip1与PAS的互作抑制mRNA 3’端的加工
在上一部分中作者已经证明了SNORD50A能调控mRNA的3’末端的加工，那么它是如何对Mrna 3’末端的加工进行调节的呢？
作者首先通过RNA pull-down实验获取与snoRNA结合的蛋白进行WB检测几种与RNA加工相关的特异因子（CPSF）（下图A），然后再用这些因子进行Clip检测snoRNA的富集（下图B），结果表明四种snoRNA都与Fip1特异结合。然后作者对细胞SNORD50A进行干扰后细胞裂解液与P32-labeled SVLpre-mRNA孵育，再用Fip1抗体进行IP检测CPSF和pre-mRNA的结合，结果表明SNORD50A敲低后Fip1与pre-mRNA结合增加（下图C）。
另外，作者用生物素标记的含P32标记的SVL-PAS与P32标记的SNORD50A进行pull-down检测发现SVL-PAS与snoRNA不结合（下图D）。EMSA结果表明SNORD50A对SVL-PAS与Fip1的结合具有竞争作用（下图E），即SNORD50A与Fip1结合后阻断SVL-PAS与Fip1的结合。
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文献原文：ChunliuHuang,Junjie Shi1,Yibin Guo,et al.A snoRNA modulates mRNA 3end processing and regulatesthe expression of a subset of mRNAs.Nucleic Acids Research,2017,15,8647–8660
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