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Flowjo处理细胞周期

Flowjo处理细胞周期

作者: 期待未来 | 来源:发表于2022-06-09 01:24 被阅读0次

1. 相关知识:

  • 通道命名方式:
    以FL(fluorescence)加数字命名,如FL1、FL2、FL3等。以该通道接收的主要荧光素命名,如FITC通道、PE通道、APC通道等。
    For example: FACSCalibur有 488nm和633nm两根激光器,488nm能检测FSC、SSC、FL1(FITC)、FL2(PE)、FL3(Perd635能检测FL 4(APC),代表Calibur有6个通道,最多能同时检测4个荧光,6种参数。
  • 般FSC和SSC变异范围较小,故使用线性放大;荧光信号变异范围较大,多使用对数放大。
  • SSC方向与激光束和液流形成的平面相垂直,亦称90度散射光,其信号强度反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化。FSC信号方向与激光束平行,偏离度- -般在1 -6度范围内,亦称小角度散射光,主要反映被测细胞的体积大小和活力。实验中,常利用FSC和SSC这两种参数的组合,区分不同的细胞群体,去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
  • 曲线调整原则:粉色的曲线为模型曲线,黑色的为样本曲线,理想状况是粉色和黑色曲线吻合-致为
    最佳。拟和的好坏可以根据右边的RMS值来判断。RMS(root mean square)值越小越好。但是这只是一
    个相对值,只在同样本不同模拟情况下,选取最小值来达到最佳拟和。你可以选中G1期的峰或G2期的
    峰,根据调节按钮调节峰的宽度
  • 含义:
    • G1期含义:细胞进行大量物质合成时期,为DNA合成做准备。
    • S期含义:开始至完成DNA的合成以及合成组蛋白。
    • G2/M期的含义: DNA复制结束和开始有丝分裂之间的间隙。
      通常,根据G1期、S期、G2期的百分含量来判断细胞周期的变化。相对于正常的细胞,加药或者照射
      的细胞的周期可能会发生变。- -般根据S+G2期的百分含量判断处理后的细胞是促进增殖还是抑制增殖。
      凋亡细胞由于细胞核发生浓缩以及发生 DNA片段化(DNA fragmentation)导致部分基因组DNA片断在染色过程中丢失,因此凋 亡细胞碘化丙啶染色后呈现明显的弱染,即荧光强度小于1,在流式检测的荧光图上出 现所谓的sub-G1峰,即凋亡细胞峰。

2. 软件操作:

  1. 打开flowjo软件,将要分析的fsc文件直接拖入软件中
  2. 去除细胞碎片(圈主细胞):双击其中一个,调节横坐标为“FSC-坐标liner处理” 纵坐标为“SSC-坐标log处理”,并用像“箭头”一样的圈出待分析的细胞群,可将细胞命名或默认为“lymphcytes”
  3. 选单细胞(去除粘附细胞,多核细胞等):横坐标设置“荧光指标-A(A:面积)”,纵坐标设置“荧光指标-H(H:高度)” 【X轴选择FL3-LIN,用来表示PI的线性信号。Y轴选择FL3-PEAK,用来表示PI的峰值信号。本实验数据采集采用的是贝克曼仪器采集的数据。(如果是****BD的仪器采集的数据,X轴选择FL2-W,用来表示PI的宽度信号。Y轴选****择FL2-A,用来表示PI的面积信号),如上图所示多倍体或异倍体细胞不予分析。】
  4. “tools” --- "cell cycle"
  5. 通常:G2是G1的两倍,也可以将G1的mean设定一个范围

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