7. qPCR
每个靶基因和参照基因的数据库检索编号；每个引物和探针在外显子的位置；每个寡核苷酸的序列和浓度；包括任何染料和/或修饰碱基的性质、位置和连接；聚合酶的浓度和性质；模板DNA和cDNA的量；Mg2+；缓冲液的化学组成（盐、pH值、添加剂）及反应体积；使用的仪器并记录PCR循环条件；因为使用的消耗品会影响热循环，所以有必要确定单管、条或板的使用及其制造商。所使用的塑料制品的透明度(如白色或透明)也很重要，因为不同的塑料在荧光反射和灵敏度方面表现出很大的差异。板子的密封方式（热合或粘合）会影响板子周边孔的样品的蒸发，应该记录。
由于PCR的效率高度依赖于使用的引物，它们的序列必须被公布。即使在商业引物上，这个要求也是完全可行的，因为有公司提供引物和探测序列的先例(http://www.primerdesign.co.uk/research_with_integrity.asp)。此外，强烈鼓励向RTprimerDB等公共数据库提交数据；随着时间的推移，这些数据库可能成为通用的交换所。
7.1 二级结构
核酸靶标的结构(如茎和环二级RNA结构)对逆转录和PCR的效率有很大的影响。因此，引物、探针和PCR扩增子的位置必须考虑RNA模板的折叠。应使用核酸折叠软件检查序列，例如，DNA的mfold (http://mfold.bioinfo.rpi.edu/cgi-bin/dna-form1.cgi)或RNA (http://frontend.bioinfo.rpi.edu/applications/ mfold/cgi-bin/ RNA-form1-2.3.cgi)。理想情况下，折叠结构应该提供给审稿人。
7.2 特异性
BLAST或等效特异性搜索等工具，对引物设计是有用的。任何明显的同源性伪基因或其他意想不到的目标都应记录和提供对齐序列，以供审查；然而，特异性必须通过直接的实验证据(电泳凝胶、溶解曲线、DNA测序、扩增子大小或限制性内切酶消化)来验证。预测寡核苷酸熔解温度的算法对于初始设计是有用的，但实际的最佳退火温度必须通过实验确定。虽然引物优化已经不再流行，但很明显，糟糕的退火优化对分析质量有很大的影响。引物二聚体的形成在探针法检测中会明显降低扩增效率，在基于SYBR Green I实验中可能产生假阳性。一些引物优化的证据应该提供给审稿人，最好以退火温度或Mg2+梯度，并表示为Cq值，荧光与循环数图/或熔解曲线。
7.3 质控品和定量校准品
除了上述RT-qPCR检测中没有逆转录对照外，所有qPCR反应都需要额外的对照或定量校准仪。当使用探针时，NTC可以检测PCR污染，还可以在SYBR Green I反应中区分无义的扩增产物(如引物二聚体)和预期的PCR产物。NTC应包括在每一板或每一批样品中，并建立数据剔除标准。例如，如果未知最低浓度的Cq为35，那么具有Cqs大于等于40的NTC可以被忽略。
阳性对照对于监测时间变化从实验样品中提取核酸是有用的，同样对于没有校准曲线时的运行也是必不可少的。
Quantification calibrators定量校准器可能是纯化的目标分子，如合成的RNA或DNA寡核苷酸跨越完整的PCR扩增子，质粒DNA构建，cDNA克隆到质粒，体外转录的RNA，参考RNA池，从特定的生物样本RNA或DNA，或者国际公认的生物标准(当它们可用时)。稀释应按确定的载体tRNA浓度进行(酵母或大肠杆菌在10-100 ng/L)。
对于人类病原体的检测，校准器可以稀释到阴性对照样本RNA或DNA中，也可以稀释到健康人血浆中，在载体tRNA存在的情况下裂解。特定模板的连续稀释可以制备成能抵抗多次冻融循环的原液。当检测到Cq变化为0.5-1.0时，应准备新批次。或者，校准曲线的溶液可以在4℃下保存一周，然后丢弃。
对于诊断性测定，qPCR应包括一个独立验证的校准器(如果可用)，该校准器位于测定的线性区间内。也建议采用阳性和阴性提取对照。
7.4 assay performance
7.4.1 PCR效率
稳定和精确的qPCR检测通常与高PCR效率相关。当目的基因的mRNA浓度与内参基因相关联时，PCR效率尤为重要。DDCq方法是确定样品间浓度差异的最流行的方法之一，基于单一内参基因的归一化。计算目的基因与内参基因的Cq值差异(DCq)，直接比较不同样本的DCq值。这两个基因必须以可比较的效率进行扩增，才能进行准确的比较。最流行的方法不一定是最合适的，然而，已经开发了替代的、更通用的定量模型来校正扩增效率的差异，并允许使用多个内参基因。
PCR扩增效率必须通过校准曲线来建立，因为这样的校准提供了一个简单、快速和可重复性的指标，以表明PCR的平均效率、分析灵敏度和检测方法的稳定性。放大效率应由校准曲线的对数线性部分的斜率来确定。x轴为初始模板浓度(自变量)的对数，y轴为因变量Cq,
PCR效率为=10-1/slope-1。理论最大值为1.00(或100%)表示产品数量随周期增加一倍。理想情况下，估计PCR效率的方法的CIs或SEs由复制的校准曲线报告。
每个量化目标的校准曲线必须包含在提交的手稿中，以便审稿人可以获得这些信息。从这些校准曲线导出的斜率和y轴截距必须包括在出版物中。PCR效率差异会产生斜率不同的校准曲线。因此，由于模板量的变化，目标和参考的Cq值之间的差异将会产生变化，相对浓度的计算也将是不准确的，产生误导的结果。C q>40是可疑的，因为这意味着低效率，通常不应该被报告；然而，使用这种武断的Cq截止并不是理想的，因为它们可能太低(消除有效结果)或太高(增加假阳性结果)。
7.4.2 linear dynamic range线性动态范围
必须描述线性的动态范围(通过校准曲线建立的最高到最低可量化拷贝数)。根据用于生成校准曲线的模板，动态范围至少应覆盖3个数量级，理想情况下应扩展到5或6
log10浓度。校准曲线的线性区间必须包括目标核酸被量化的区间。由于定量检测下限通常比较难，因此应确定线性区间内的最低浓度的变化。必须报告相关系数(r2)，理想情况下，CIs应该在整个线性动态范围内提供。
7.4.3 LOD
The LOD is defined as the lowest concentration at which 95% of the positive samples
are detected. 能检测95%阳性样品的最低浓度。换句话说，在一组含有目标浓度LOD的重复中，不应出现超过5%的失败反应。低拷贝PCR是随机限制的，每个PCR的lod为﹤3拷贝是不可能的。然而，如果进行多个反应，则可以通过数字PCR获得较低浓度的准确定量。事实上，浓度校准器可以通过限制稀释度来检查，以显示失败和成功反应的百分比遵循泊松分布。
7.4.4 精密度
qPCR结果的变化有很多解释，包括影响退火和/或变性完成的温度差异，移液误差带来的浓度差异，以及随机变化。qPCR的精度通常随浓度的变化而变化，随着拷贝数的增加而降低。理想情况下，分析内变异(重复性)应以SD误差的形式表示，或在重复样品的校准曲线上以CIs的形式显示。CV不应与Cqs(29)一起使用，但可用于表示拷贝数或浓度的差异。这种技术变异应与生物变异区分开来。生物重复可以直接解决组间或处理间qPCR结果差异的统计学意义。对于诊断分析，可能还需要报告不同位点和不同操作人员之间的分析间精确性(再现性)。
7.5 多重PCR
多重检测的能力极大地扩展了qPCR分析的能力(66,66)，特别是应用于点突变或多态性的检测. 多重检测需要提供证据，证明多个目标在一个管中的准确定量不受影响，即，分析效率和LOD与单管分析时相同。当丰度明显较低的目标与丰度较高的目标进行共扩增时，这一问题尤为重要。
8 数据分析
数据分析包括对原始数据的检查，对其质量和可靠性的评估，以及生成可报告的结果。描述了各种数据收集和处理策略，系统评价表明，qPCR数据分析方法的性能有很大差异。关于数据分析和confidence
estimation的详细资料以及所使用的软件的说明是必要的。必须确定识别异常值的方法和处理这些数据的方法。记录分析精度需要识别用于评估方差(如95%CIs)的统计方法，并提供相应的浓度或Cq值。这些信息应包括可重复性和可再现性数据(如果有的话)。如前所述，为Cqs报告CVs是不合适的(29)，因为Cqs总是比根据拷贝数计算的CVs(因此可能会产生误导)。必须提供关于用于评估准确性的方法的资料，包括报告的组间差异的统计意义。
8.1 归一化Normalization
归一化是可靠的qPCR检测的重要组成部分，因为该过程控制了提取率、逆转录率和扩增效率的变化，从而能够比较不同样品的mRNA浓度。使用内参基因作为内控是规范化细胞mRNA数据的最常见方法，然而，尽管内参基因被普遍认为是最合适的标准化策略，但它们的效用必须在特定组织或细胞类型和特定的实验设计上经过实验验证。不幸的是，尽管人们越来越意识到系统验证的重要性，尽管使用不适当的内参基因进行标准化可能产生的高度误导效应已广为人知，但这些考虑仍然被广泛忽视. 因此，许多分子分析仍然包含未标准化的qPCR数据。
归一化包括报告感兴趣基因的mRNA浓度与内参基因的mRNA浓度之比。内参基因mRNA应稳定表达，其丰度应与样品中mRNA的总含量有很强的相关性。
不提倡采用单一内参基，除非研究人员向审稿人提供明确的证据，证实其在所述实验条件下的没有表达差异。内参基因的最佳数量和选择必须通过实验确定并报告方法。
8.2 生物系统的固有变异
生物系统的内在可变性可以等于或超过不同群体之间的实验差异。当使用许多生物重复来增加实验的统计显著性时，这种变化经常被观察到。虽然生物重复之间的差异可能很大，但足够的数量可以使较小的实验差异被识别。最近的一份出版物提供了处理此类数据以及如何从受高生物变异影响的化验中得到有生物学意义的数据的教科书范例。许多因素促成了实验的变化，并影响了生物重复的数量，必须达到一定的统计能力。因此，功率分析对于确定有效结论所需的样本数量是有用的。
8.3 定性分析
使用PCR仅仅检测核酸模板的存在，而不是对其进行准确的定量，被称为定性PCR，广泛用于病原体诊断。PCR方法的定性/定量分层的问题是，准确的是/否答案需要关于PCR检测的低端灵敏度的信息。因此，即使是定性分析也应提供有关分析性能特征的信息。
原文链接：https://academic.oup.com/clinchem/article/55/4/611/5631762?login=false
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