定量包括两种类型:全长以及基于标签(tag)。前者对每个转录本都试图获得一致的read覆盖度,后者只捕获5‘或者3’端的RNA。定量方法的选择也影响了后续分析的方法选择。理论上,全长的方法应该得到转录本的平均覆盖度,但是实际上,覆盖度经常是有偏差的。基于标签的方法能够利用特异性分子标记(Unique Molecular Identifiers, UMIs)提高定量准确度,但是呢,这种限制了转录组一端的方法有降低了转录本的可拼接性,让以后的isoform识别变得困难。
捕获的技术决定了细胞如何被筛选、获取怎样的测序外的补充信息、数据产量,三种最常用的方法是基于微孔microwell、微液流microfluidic、微滴droplet。
基于微孔的捕获技术可以使用细胞移液器或激光捕获分离细胞,并将他们放置于微液流孔中。这样的一个优势就是:可以与荧光触发细胞分离技术(FACS)结合,实现基于表面标记的细胞选择。对于想要分离特定细胞群的研究很有效;另外一个优势就是,可以对细胞进行拍照,帮助确定孔中是否存在损伤的或者重复的细胞。当然,他也有缺点,通量低,对每个细胞进行操作需要很大的工作量。
基于微液流的捕获技术,相对微孔,它的通量更高。但是他的弱点就是:只有10%的细胞能被捕获到,加入处理的细胞类型比较稀少,那么能被芯片捕获的就更少了,数据产出是不够的。另外芯片相对较贵,但是试剂的价格再降低,日后可能总的价格也会下降。
微滴技术是将单个细胞包裹在µl级别的液滴中,液滴被搭载到建库所用的酶上,每个微滴包含一个独特的条码(barcode),由那个被包装好的细胞产生的所有reads都被贴上了该条码,也是为了之后对于不同细胞reads的分辨。一般微滴技术的通量最大,查资料得知一秒能包装7万个以上的液滴,并且建库费用合适--0.05美元/细胞。但是高额测序费用又成了他的短板,鉴定出的一般只有一千多个差异转录本,覆盖度还是比较低的。
微滴技术所以总结来说,关于捕获,比如:如果想要分析组织中的成分,那么微滴技术可以提供数量可观的细胞;如果研究的细胞种群比较稀少,并且有已知的标记,那么最好用FACS,测少量细胞即可;
关于定量,比如:如果想要研究不同的转录本,由于标签是有限的,不可能全部标记完这些转录本,那么全长的转录本定量就更合适;UMIs只能用于使用标签的方法,在基因水平做定量更有优势。
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