植物病害对全球粮食安全构成了重大威胁，了解植物疾病发生机制，对制定有效的病原菌防御策略具有重大影响。但是，由于病原菌在宿主体内是一个动态过程，不同植物细胞和组织对病原菌的精确反映仍不清楚。
最近，英国赛恩斯伯里实验室在Cell Host & Microbe上发表了题为“Cell-type-specific responses to fungal infection in plants revealed by single-cell transcriptomics”的论文。该研究通过单细胞转录组学揭示了植物对真菌感染的细胞类型特异性响应。
Cell-type-specific responses to fungal infection in plants revealed by single-cell transcriptomics
========实验设计=======
将希金斯炭疽菌接种到14天的拟南芥，然后对于感染后的24 h和40 h的拟南芥样本进行取样。
========实验结果=========
1. 希金斯炭疽菌感染期间拟南芥叶片细胞转录组图谱
收集接种希金斯炭疽菌感染后的24 h和40 h的拟南芥样本，这两个时间点分别代表侵染的早期和晚期（图1A）。制备原生质体后，利用10X进行单细胞转录组测序。共得到95,040单细胞，覆盖23,809基因，每个细胞平均检测到2,583个基因和5,491个UMI（图1B）。降维聚类后获得25个细胞簇，其中12个簇为叶肉细胞，6个簇为维管素细胞，4个簇为表皮细胞，2个簇为保卫细胞（图1C）。进一步分析不同处理细胞在每个细胞簇中的比例，发现来自不同处理的细胞比例在不同簇间有很大差异，其中40 hpi时观察到的差异最显著（图1D）。
图1
2. 免疫受体相关基因的细胞类型特异性表达
然后作者鉴定了病原菌侵染后的差异表达基因。从与普通RNA-seq的对比可以看出，一些RNA-seq鉴定不出来的差异基因可以通过单细胞测序鉴定出来，说明单细胞测序能揭示一些细胞异质性的表达（图2A）。
鉴于细胞内免疫受体NLRs在植物防御中的重要作用，作者探索了不同家族在不同细胞类型的表达模式。作者首先利用NLRtracker鉴定出214个假定NLRs的基因，其中169个在scRNA-seq数据集中可检测到。一部分TNL基因，如RPP1、RPP5、 SNC1和RPS6，主要在原形成层细胞中表达（图2B）。而另一个TNL基因子集则仅在24 hpi时于韧皮部伴侣细胞中高度诱导表达，包括RRS1B、CSA1和CHS1等编码基因。在多种细胞类型中，少量TNL是由真菌感染诱导的，如RPS4在表皮、守卫、原形成层和韧皮部伴生细胞中表达增加。
基于此发现，作者又从global的角度查看了不同NLR家族在不同细胞类型的表达pattern（图2C）。类似的，可以发现TNL家族在维管束相关的细胞类型在真菌感染后显著上升。
图2
TNL一般含有TIR结构域。但是除了TNL外，TIR结构域也存在于其他蛋白质中。作者生成了含TIR结构域蛋白的系统发育树（图3），并将scRNA-seq数据映射到每个基因，并将TIR结构域的蛋白分为3组，其中维管结构细胞仅在TNL组中富集表达，相反，其它组中的许多基因，特别是编码非TNL的基因，在scRNA-seq中无法检测到，表明相对较低的表达水平。这些结果说明植物细胞中不同类型的免疫受体之间存在潜在的协调。
图3
3. 与真菌分布相关的基因表达的空间异质性
真菌感染是一个时空动态的过程，只有一部分植物细胞直接接触到病原体。作者通过在单细胞水平上捕捉真菌感染过程中逐渐发生的基因表达变化，进行了轨迹分析。24小时感染组的细胞富集在轨迹曲线中间区域，而40小时感染组的细胞主要在轨迹时间值的0.5到1之间（图4A）。
以一个已知的早期免疫反应marker基因FRK1为例，表达高水平FRK1的细胞在40 hpi的表皮细胞样本中富集（图4B）。通过激光显微切割方法，发现接被真菌定植的细胞中观察到最强的黄色荧光信号，而在邻近的细胞中荧光水平逐渐降低（图4C）。真菌感染后差异表达基因也可以看出在轨迹上也是在后期显著富集（图4D）。从轨迹上表达差异基因的GO估计结果也可以看出，分泌相关的通路在晚期被显著富集，这是后期抗菌作用也是息息相关的（图4E）。这些结果表明轨迹曲线所代表的细胞动态反应反映了真菌病原体在受感染组织中不均匀分布所决定的空间异质性。
图4
4. 在感染位点气孔细胞的特异响应造成了气孔的关闭
和前面表皮细胞细胞类似，marker基因FRK1在40 hpi的气孔细胞中也显著富集（图5A）。轨迹上差异基因富集分析结果也表明在晚期，硫代谢通路显著诱导（图5B）。而硫代谢通路往往是和ABA响应相关的，这些影响着气孔的开合。所以作者查看了ABA相关基因在气孔细胞的表达pattern。结果显示ABA正调控因子随着轨迹逐渐上升，而负调控因子随着轨迹逐渐下降（图5C）。说明ABA在感染的过程中被动态激活了。而ABA是气孔闭合的一个关键调控因子，所以作者又查看了在病原菌侵染过程中气孔的表型，和预测的类似，气孔在病原菌侵染后明显闭合（图5D）。
图5
4. 感染位点激活硫代葡萄糖苷（GSL）生物合成导致细胞类型特异性的基因表达
将感染位点的细胞与整个图谱进行比较，所有4种细胞类型中只有16个基因被诱导。相比之下，在表皮、 保卫、叶肉和维管细胞中分别有541、351、2和20个基因被特异性诱导。说明了基因表达发生了强烈的细胞类型特异性变化，特别是在表皮和保卫细胞中（图6A）。
硫代葡萄糖苷（GSL）相关代谢在病原菌抵抗中发挥重要作用，核心GSL途径中的8个基因中有5个，吲哚GSL（IG）特异性途径中的14个基因中有8个， 脂肪GSL (AG)特异性途径中的15个基因中有1个，在至少一种细胞类型的感染位点被诱导（图6B）。有意思得是，许多GSL相关基因表现出细胞类型特异性表达。例如，编码ASA1和TSB1的IG特异性基因在表皮、维管系统和保护细胞中被诱导，但在叶肉细胞中却没有。编码核心GSL生物合成成分的SUR1和SOT16转录本在感染部位的保护细胞和维管细胞中富集，而在表皮或叶肉细胞中不富集（图6C）。
有三种转录因子通过调节该途径中几种关键酶的表达来调节GSL的生物合成，但只有MYB51和MYB122在感染位点表现出诱导作用，MYB122仅在表皮中诱导，而MYB51仅在维管细胞中诱导表达（图6B和6C）。将希金斯炭疽菌接种至myb122突变植物，真菌感染加速（图6D，6E和6F）。这表明MYB122可能在抑制希金斯炭疽菌的生物营养生长方面发挥潜在作用。
图6
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