文章题目：CD5L/AIM Regulates Lipid Biosynthesis and Restrains Th17 Cell Pathogenicity
发表时间及期刊：2015年12月发表在Cell期刊
影响因子：2020/2021: 38.637
作者：Chao Wang, Nir Yosef, Vijay K. Kuchroo*
单位：哈佛医学院
一句话概述：
CD5L作为Th17细胞功能状态的一个关键开关，通过改变脂质代谢和主转录因子Rorgt的功能来调节其引起疾病的能力。
Highlights
•CD5L优先在非致病性Th17细胞中表达
•CD5L是体内Th17细胞功能状态的主要开关
•CD5L调控T细胞脂质组与Th17细胞功能相关
•CD5L通过PUFA/SFA平衡和Rorgt配体的可用性来改变T细胞的功能
SUMMARY
Th17细胞在宿主防御细胞外病原体和组织稳态中起着关键作用，但也能诱导自身免疫。平衡“致病性”和“非致病性”Th17细胞状态的机制仍在很大程度上未知。
我们使用单细胞RNA-seq鉴定CD5L/AIM作为在非致病性细胞中表达的调节因子，但在致病性Th17细胞中不表达。虽然CD5L不影响Th17的分化，但它是一个调节Th17细胞致病性的功能开关。
CD5L的缺失可将非致病性Th17细胞转化为诱导自身免疫的致病性细胞。CD5L通过调节细胞内脂质组、改变脂肪酸组成和限制胆固醇的生物合成，从而调节Th17细胞的主转录因子Rorgt的配体可利用性来介导这一效应。
我们的研究确定了CD5L是Th17细胞功能状态的关键调控因子，并强调了脂质代谢在平衡T细胞诱导的免疫保护和疾病中的重要性。
INTRODUCTION
产生IL-17的Th17细胞存在于组织炎症部位，并有助于人类自身免疫性疾病和相关小鼠模型的发病机制。然而，并不是所有的Th17细胞都会诱导组织炎症和疾病（即具有“致病性”）。正常肠道黏膜上的Th17细胞通过防止肠道菌群的入侵和促进上皮屏障功能来调节组织稳态。在体内控制Th17细胞这些不同功能的细胞外信号和细胞内机制尚未确定。
不同的细胞因子组合也可以在体外产生具有不同效应功能的Th17细胞。两种细胞因子IL-6和TGF-b1可以在体外将幼稚T细胞分化为Th17细胞，尽管这些细胞是实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的不良诱导剂，这是人类多发性硬化症的自身免疫性疾病模型。暴露于促炎细胞因子IL-23可将这些细胞转化为致病的致病性Th17细胞。其他细胞因子组合，如IL-1b+IL-6+IL-23或TGF-b3+IL-6+IL-23也可以诱导Th17细胞引起严重组织炎症的EAE。
非致病性：TGF-b1+IL-6
致病性：TGF-b1+IL-6+IL-23 ； TGF-b3+IL-6+IL-23 ； IL-1b+IL-6+IL-23
通过比较用不同的体外分化方案产生的Th17细胞的基因表达谱，发现了一个区分致病性和非致病性Th17细胞的特征，由16促炎基因表达在致病性Th17细胞(例如，T-bet，GMCSF和IL-23R)和7调节基因在非致病性细胞(如IL-10)。非致病性Th17细胞暴露于IL-23可将其转化为致病性表型，调控特征的表达减少，并获得促炎特征基因，这表明IL-23是决定Th17细胞功能表型的主细胞因子。
致病性细胞中表达：T-bet，GMCSF和IL-23R
非致病性细胞中表达：IL-10
识别驱动致病性和非致病性Th17细胞的特异性分子开关将允许选择性抑制致病性Th17细胞，同时保留非致病性、潜在的组织保护性的Th17细胞。迄今为止，IL-23在分化Th17细胞过程中诱发致病表型的细胞内机制尚不清楚。基因组方法提供了一种引人注目的无偏方法来发现这种机制，但致病和非致病细胞可能在体内共存并在体外共分化，限制了我们在群体水平上检测微妙信号的能力。事实上，我们之前的研究比较了体外来源的致病性细胞和非致病性细胞的群体，并没有发现强的候选调控因子，而是效应分子。单细胞RNA-seq的出现为识别这种更微妙但生理上重要的调控因子开辟了道路。
在这里，我们使用了来自体内自身免疫性病变和体外分化的Th17细胞的单细胞RNA-seq谱，并确定了一种新的Th17致病性调节因子，CD5样(CD5L)。CD5L主要在非致病性Th17细胞中表达，并在暴露于IL-23时表达下调。CD5L的缺失通过调节Th17细胞的脂质组，将非致病性的Th17细胞转化为诱导疾病的Th17细胞。CD5L降低了多不饱和脂肪酸酰基(PUFA)的水平，影响关键胆固醇生物合成酶的表达，进而影响th17细胞分化的主转录因子Rorgt的结合和活性。因此，我们发现CD5L是区分Th17功能状态的关键调控因子，并确定T细胞脂质代谢是调节Th17细胞致病性的通路的一个重要组成部分。
RESULTS
1. 单细胞RNA-Seq鉴定CD5L是致病性的候选调节因子
怎么就发现CD5L是重要的调控因子了呢？
为了鉴定Th17细胞功能的调节因子，我们分析了在体内或体外分化的非致病性(TGF-b1+IL-6)和致病性(IL-23)条件下分离的Th17细胞的单细胞RNA-seq谱
我们使用三条线去排名基因的潜在的致病性：
（1）对体外分化的Th17细胞(TGF-b1+IL-6)转录组与第一主成分做相关性。显示存在两个反相关模块：“促炎模块”(与Il17a表达正相关)和“调节模块”(与Il10表达正相关)
（2）共变异(TGF-b1+IL-6)与细胞致病性评分，定义为我们之前定义的促炎和调节信号的基因平均表达的差异；
（3）转录本与体内EAE期间从中枢神经系统和淋巴结分离的单个Th17细胞的前两个pc的相关性。
这些研究表明，Th17细胞跨越了第一个PC（从效应器、记忆到耗尽状态）和第二个PC（从幼稚样状态到最终分化状态）的功能谱。
Fig1(A)Cd5l表达来自体外生成的Th17细胞和体内从小鼠EAE模型中分离出来的Th17细胞(IL-17。GFP+)。
Fig1(B)非致病性Th17细胞(TGF-b1+IL-6)与(B)的细胞致病性评分(评分标准来源文献 Lee et al., 2012)；（Wilcoxon秩和检验），比较Cd5l表达与非表达细胞的细胞致病性打分。
Fig1(C)基于单细胞的促炎（红色）和调节（绿色）模块的创始特征基因（实条，显著相关 [p < 0.05];条纹条，相关性不显著)
Fig1(D-E))在体外验证CD5L的表达。对幼稚T细胞(CD4+CD62L+CD44-CD25-)进行分类和分化，并在48(D)和72小时(E)通过qPCR分析CD5L的表达
Fig1(E)，在48小时通过流式细胞术在新鲜培养基中加入48小时的IL-23或对照组。图中是三个独立实验的总结
Figure S1. Single-Cell RNA-Seq Identififies Cd5l as a Gene in Covariance with the Pathogenic Module within Non-pathogenic Th17 Cells,
Related to Figure 1
(A) Histogram of Cd5l expression in single cell from unsorted in-vitro derived Th17 cells differentiated under the TGF-b1+IL-6 condition. (B) The expression of Cd5l
within single cell is shown in covariance with the fifirst PC of in-vitro derived cells as in (A) where it correlates with the pro-inflflammatory module. (C) Within the same
PC space as in (B), score of pathogenic signature is shown to also correlate with PC1 as defifined in the text. (D, E) Regulation of CD5L expression.
Cd5l是一个高级的基因的单细胞分析潜在的监管机构，表现出两个令人惊讶的特点：尽管Cd5l表达在Th17细胞在非致病性条件下（图1），在这些非致病性细胞，Cd5l与第一个PC的细胞在体外来源的状态下和促炎模块都是呈现正相关(图S1A-S1C)。此外，Cd5l与细胞致病性评分呈正相关(图1B和1C)。比较Th17细胞单细胞水平Cd5l的表达(IL-17。GFP+)的结果显示，IL-1b+IL-6+IL-23衍生的Th17细胞80%缺乏Cd5l表达，而TGF-b1+IL-6分化的Th17细胞主要表达Cd5l(图1A)。Cd5l即不在可选的致病条件下分化的Th17细胞(TGF-b3+I-L-6)，也不在从活性EAE小鼠中枢神经系统中分离的脑源性Th17细胞中表达(Figure 1A)。然而，非致病性Th17细胞中表达的Cd5l(图S1A)，与第一个PC相关，也与促炎模块(图S1B)相关，促炎模块表明致病性特征(图S1C)，来源文献(Lee et al.，2012)。此外，Cd5l与促炎模块的定义特征相关，与调节模块的定义特征呈负相关(图1C)。最后，它是单细胞促炎模块中的前8个基因之一，其表达与我们之前定义的致病基因签名最密切相关(图1B)。
CD5L是富含半胱氨酸的超家族的成员(Sarriasetal.，2004)。并能结合脂肪细胞内吞后的胞质脂肪酸合酶(Iamanioetal.，1999)。CD5L也是病原体相关分子模式(PAMPs)的受体，可能调节先天免疫反应(Martinesetal.，2014)。然而，其在T细胞中的表达尚未见报道，其在T细胞功能中的作用也尚未确定。
2. CD5L的表达在体内外与非致病性Th17细胞相关
我们假设，CD5L在非致病性Th17细胞中优先表达，但与促炎模块相关，可能反映了CD5L在调节非致病性和致病性状态之间的过渡中的独特作用。
使用qPCR和流式细胞术分析在不同分化条件下培养的幼稚CD4T细胞，验证并扩展了我们最初的发现，即CD5L在非致病性Th17细胞中唯一表达(图1D-1F)。在mRNA水平上，我们发现在Th0、Th1或Th2辅助T细胞中表达很少，在TGF-b1+IL-6分化的Th17细胞中高表达，而在IL-1b+IL-6+IL-23分化的Th17细胞中低表达(图1D)。蛋白质测量证实了大部分非致病性Th17细胞中存在CD5L(图1F)。
接下来，我们探讨了在体内CD5L的表达是否与致病性较低的Th17细胞相关。我们分析了从EAE诱导的小鼠中分离出的Th17细胞。Th17细胞(CD3+CD4+IL-17。GFP+)从脾脏中分离出来，表达Cd5l，而IL-17-T细胞不表达（图1G）。CD5L是一种在非致病性Th17细胞中表达的基因。
我们想知道是否IL-23（已知可以使Th17细胞更具致病性），是否可以调节Cd5l的表达。我们假设，如果CD5L是il-23依赖的致病性的正调控因子，那么IL-23会增加其表达，而如果它是负调控因子，其表达会被抑制。由于IL-23R在T细胞激活后被诱导，我们用TGF-b1+IL-6分化幼稚T细胞48小时，并在新鲜培养基中在IL-23中扩增。IL-23抑制了Cd5l(图1E)，这与这些细胞获得促炎模块并成为致病性Th17细胞相一致，也与我们假设的CD5L作为致病性的负调控因子相一致。STAT3可以促进CD5L的表达，但RORgt不能促进(图S1D和S1E)。由于IL-23可以增强STAT3的功能，因此需要进一步的研究来阐明参与调控CD5L表达的途径。
3. CD5L抑制效应的功能而不影响Th17的分化
CD5L什么功能？
为了分析CD5L在体内的功能作用，我们用MOG35-55/CFA免疫小鼠，诱导EAE。CD5L-/-小鼠表现出更严重的临床EAE，持续了至少28天，而野生型(WT)小鼠在免疫后12天开始恢复(图2A)。.在WT和CD5L-/-小鼠中也发现了类似频率的FoxP3+CD4+Treg细胞，这表明疾病的严重程度的增加不是由于CD5L-/-小鼠中Treg数量的变化(图S2A)。相比之下，在CD5L-/-小鼠的中枢神经系统中，更多的CD4T细胞产生IL-17，而产生IFNg的细胞更少(图2a和S2B)。在体外响应MOG再激活后，来自CD5L-/-小鼠引流淋巴结的细胞表现出更高的增殖反应，并产生更多的IL-17(图S2C和S2D)。这些观察结果与CD5L在定义Th17细胞功能中的直接或间接作用相一致。
通过分析特征基因的表达，研究CD5L对从幼稚WT和CD5L-/-T细胞分化Th17细胞的影响。通过IL-17的表达测量，CD5L缺失并不影响Th17的分化(图2B和2C)，也不影响其他Th17特征基因，包括Il17f、Il21、Il23r、Rorc或Rora(图2D)。值得注意的是，在非致病性分化条件下，CD5L-/-Th17细胞产生较少的IL-10(图2C和2D)。这些观察结果表明，分化的变化不能单独解释CD5L-/-小鼠对EAE易感性的增加，但CD5L可能确实影响Th17分化的内部状态。
我们确定了CD5L是否可以调节效应/记忆性Th17细胞通过非致病性Th17细胞的分化。在重新刺激后，更多的CD5L-/-Th17细胞产生IL-17并表达IL-23R，但不影响活力(图2E和数据未显示)，表明CD5L缺失导致Th17细胞更稳定的扩增。一致地，CD5L-/-Th17细胞表达更多的Il17和Il23r，更少的Il10，以及类似水平的Rorc或Rora(图2F)。因此，CD5L并不调节Th17细胞的分化，但会随着时间的推移而影响Th17细胞的扩增和/或效应功能。从CD5L-/-小鼠体外分离的效应记忆细胞(CD4+CD62L-CD44+)具有较高频率的IL-17+和较低频率的IL-10+细胞(图2G和S2E)，可能反映了CD5L-/-小鼠中存在的Th17细胞的稳定性。为了证明是否Th17细胞体内也产生更多的IL-17，我们分离RORgt+(GFP+)效应/记忆T细胞从WT和CD5L-/-小鼠中，发现更多IL-17+和更少的IL-10+细胞CD5L-/-细胞，认为RORgt+细胞在没有CD5L的条件下，产生更多IL-17。(图2H和S2F)。
4. CD5L是调节Th17细胞致病性的主要开关
如何证明某个基因的关键作用？
为了确定CD5L的缺失是否可以将非致病性Th17细胞转化为诱导疾病的Th17细胞，我们将CD5L-/-小鼠与表达MOG35-55/IAb特异性T细胞受体的2D2转基因小鼠杂交.初始CD5L-/-2D2T细胞在非致病性(TGFb1+IL-6)Th17条件下分化，并转移到WT受体中。WT和CD5L-/-2D2幼稚细胞也产生了类似频率的IL-17+T细胞(图3A)，这与CD5L不影响Th17分化的观察结果一致。
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