在药物研发早期必读结题文章中提到了体外药效在药物研发领域中的位置，今天分享一篇描述更清晰、内容更丰富的文章。
Assay development in drug discovery
说这是一篇文章并不确切，它其实是Indira Padmalayam博士在某个会议上宣讲用的PPT。
因为是PPT，缺少了很多连接的内容和对图片进行说明的文字，本篇有所补充，加入了一些经验之谈，不当之处，责任全在笔者，与原作者无关。
PPT共40页，涵盖了药物研发过程中assay方法建立的重要指标、分类、技术原理、数据分析以及图片丰富的例子，内容很多，分两次更新。
Assay development总览
一张全景图看一下Assay development在药物研发过程中的位置。
中心位置！
从庞大的化合物库中筛选找到到hit，方法建立至关重要。
何为hit？（看完下面的定义，我决定以后不是逼不得已，就不翻译类似hit这样的词了）
A “hit” is a compound which has the desired activity in a compound screen and whose activity is confirmed upon retesting.
Assay development耗时以月计，而转化之后的HTS仅以周计。
瓶颈
制约因素按比重从大到小依次为：缺乏高质量的试剂/细胞株（44%）、全新靶标/靶标复杂（21%）、HTS兼容（17%）、产量/成本（10%）、HTS 实验室外部沟通（8%）。
制约因素
药物研发的两条路径对assay development的影响
1. 生理导向/Physiology-based
靶标未知
基于生理功能/表型的改变进行评价：如病毒感染的细胞毒作用
多为细胞水平的assays
2. 靶标导向/Target-based
靶标已知
基于靶标活性/表达量进行评价
生化水平/细胞水平的assays均有
两条路径并不矛盾，有的药物研发项目也两条腿走路。
确保方法建立成功的6个关键问题：
1. 我们的目的是抑制还是激活靶标？
2. 我们试图调节靶标的什么功能？
3. 该功能可以通过什么类型的assay实现？
4. Primary assay还是Secondary assays？
5. 哪种assay更适合转移至HTS？
6. 后续进行构效关系研究的HTS assays？
概括来说，考虑的指标包括：相关性、精确性、可靠性、可行性，成本以及自动化。
“The quality of an assay determines the quality of the data: compromising on assay development can have substantial downstream consequences”
凑合的assay，只能得到凑合的hit——或者，什么也得不到。
Assay的分类
【1】根据研究对象分类
1. 生化水平的assays（靶标导向）
测定纯化后的靶标的功能：
活性实验：酶（如激酶、蛋白酶）
结合实验：受体（如核受体、受体激酶、离子通道、GPCRs）
改变靶标蛋白活性或者结合功能的化合物的确认：
靶标蛋白的重组、分离和纯化
监测产物读值的改变
这种assay中研究的靶标包括：激酶、ATP酶、磷酸酶、蛋白酶、离子通道受体、GPCR、核受体等等。
常见的靶标
优点：
-简单
-重复性好
-直接检测靶标的功能
-可以测定化合物的Kd等动力学性质
-可以提高化合物的特异性
缺点：
-可能无法反应真实的生理情况
-无法测定化合物的膜透过性、毒性、脱靶效应等性质。
2. 细胞水平的assays（表型导向）
测定细胞内靶标的功能：
-转录产物的变化、第二信使的表达水平、细胞活力（细胞死亡/调亡）、细胞增殖
测定靶标的表达水平：
mRNA水平，蛋白表达量，定位靶标
基于对靶标功能的检测，提供化合物功能活性数据。
举例：报告基因实验、活力检测、GPCR和离子通道实验、qPCR等等。
优点
-更接近生理水平
-可以测定化合物的膜透过性、毒性、脱靶效应等性质。
缺点：
-复杂
-噪音高
-不能评价溶解性或者透过性不好的化合物
对于上述两类assay，需要考虑的引起实验偏差的因素分析如下。
对于生化水平的实验：
•pH
•温度
•离子浓度
•试剂的溶解性、稳定性、聚集、加入顺序
•仪器
对于细胞水平的实验：
除了上述因素之外，还包括：
•细胞培养的器皿
•培养基
•培养条件
•血清
•细胞周期
•细胞代次
【2】根据技术手段分类
1. 基于荧光检测的assays
荧光基团发光原理
简单来说，荧光基团是这样一类物质，它们被特定波长的光照射后，会跃迁呈现激发单线态，并在恢复基态的同时释放出比吸收光波长更长（能量更小）的荧光。
最常见的应用之一就是在酶的底物上耦联一个荧光基团。荧光基团偶联底物之后，只能产生微弱荧光，而酶水解底物之后荧光基团被释放出来，产生强荧光。
优点：高灵敏度、易于建立/实施
缺点：化合物荧光干扰，导致的假阳性
具体应用：FI，FRET，TR-FRET，FP
荧光共振能量转移(FRET)/TR-FRET
FRET
原理：供体和受体两个荧光基团的发射/激发光谱重合
HTRF原理
-供体被激发后发射光的能量转移给受体，使得受体被激发，产生发射光
-距离至关重要
•应用：相互作用的蛋白-蛋白，相互结合的抗体-抗原之间，配对的DNA-DNA，DNA-蛋白
•优点：
-均相
-耗时短，价格低，HTS兼容
•缺点
-荧光基团半衰期太短，导致背景过高
时间分辨荧光共振能量转移/TR-FRET
•高级别的FRET
-采用长荧光寿命的荧光基团，通过时间分辨技术检测以降低背景噪音
-稀土元素（镧系元素）：钐(Sm)，铕(Eu)，铽(Tb)，镝(Dy)
•优点：
-低背景值，高信噪比
•缺点：
-镧系元素吸收光的能力很差，必须和有机物结合再借助有机物捕获的光转移给镧系元素。
荧光偏振 (FP) assay
偏振光和荧光偏振
原理：
小的、未结合蛋白的荧光基团，转动迅速，偏振光经过时，会因为被散射产生方向不同的发射光，检测同一个平面上的发射光可以测定这种变化。
和大分子结合之后的荧光基团，转动缓慢，偏振光经过时，不会被散射，产生的发射光仍然在同一平面。
应用：研究分子间相互作用，如蛋白和蛋白间的相互作用，受体和配体的相互作用，DNA和蛋白间的相互作用，酪氨酸激酶assay等。
优点：
高灵敏度（低至pM级别）、均相、不改变样品性状，因此同一样品可以多次检测。
缺点：
可能需要优化反应条件，以确保所有的靶标结合位点都被荧光标记的配体饱和了（也可以替代为未标记的配体）。
2. 检测冷光/Luminescence的assay
会发光的报告蛋白
•化学反应发光
•生物发光指的是生物体内能够发光的物质（比如萤火虫体内的荧光素酶）
相信做过assay的小伙伴多用过promega的kit，他们家算是把luminescence的asaay发掘到了极致。
Assay 开发远比HTS有技术含量得多，建立在对靶点、实验条件和技术手段充分理解的基础之上。为此提供支持的包括各类公司，提供靠谱的target或细胞系，提供可靠的仪器，提供先进的检测试剂盒，当然还有专业的CRO公司，提供整体的解决方案。
医药行业已经被细分成无数的子行业，仔细分析，辨别出来哪些会被机器取代，哪些更需要高价值的人，就像发现hit一样重要。
好在这个库不大，你一定找得到。
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