原标题：Genomic Signatures of Coevolution between Nonmodel Mammals and Parasitic Roundworms

作者：Yibo Hu 博士等，魏辅文院士为通讯作者。
作者单位：中科院动物所、昆明动物所、动物进化与遗传前沿交叉卓越创新中心（中科院昆明）。
发表期刊：molecular biology and evolution
原文：https://academic.oup.com/mbe/advance-article/doi/10.1093/molbev/msaa243/5910001

摘要：

寄主和寄生生物之间的对抗性协同进化（互害协同进化）推动物种演化。然而，大多数研究仅仅着眼于寄生生物的适应性进化，而没有分别从其两者的角度研究协同进化的机制。本研究通过对大熊猫蛔虫、小熊猫蛔虫和狮蛔虫的de novo测序及基因组组装，从基因组层面研究寄生蛔虫的寄生机制以及其与宿主之间的协同进化机制。基因组系统发育关系表明，这些寄生蛔虫并没有与宿主发生系统发育上的协同进化。组织蛋白酶Z（CTSZ）和辅胺酰基4-羟化酶beta亚单元（prolyl 4-hydroxylase subunit beta；P4HB）这两个免疫协调蛋白是寄主与寄生生物之间蛋白互作的核心角色。通过比较系统发育树，发现7对具有相同拓扑的互作蛋白对，揭示了它们在寄主-寄生生物互作中的协同进化。这些协同进化的蛋白与免疫应答关系紧密。进一步地，我们发现在大小熊猫中，其寄生蛔虫具有更高的金属肽酶编码基因比例，并且部分受正选择的基因与其幼虫的快速生长密切相关。本研究为非模式哺乳类与寄生物种之间的系统进化提供了新的观点和认识，并从科学的角度为大小熊猫预防蛔虫病提供了宝贵的基因组材料。

野生大熊猫感染蛔虫病的几率大于50%，是野生大熊猫死亡的主要因素之一。

实验分析分三步走：1、全基因组测序及拼接，通过比较基因组的方法确定寄生机制的基因组信号。2、通过结合寄生虫生活史探究寄主与寄生生物的蛋白互作。3、通过基因树拓扑的分析，检测非模式哺乳类与寄生生物之间的协同进化信号。

部分要点：

1、基因组测序及拼接

在基因组拼接中，除了测序深度、scaffold N50外，还可以（1）通过单拷贝orthologs评估（BUSCO assessment），计算线虫特有保守基因有百分之多少出现在该assembly中，数值越高组装效果自然越好。（2）计算BUSCO assessment中多少基因的注释是显示“complete”的，也就是基因是完整的，而非断裂局部的。（3）通过基因注释，计算百分之多少的基因集是可以被注释的，也是评估的方法。

2、寄生机制与基因组功能

结合狗体内的、猪体内的以及秀丽隐杆线虫物种，共计六个物种的蛋白酶体抑制因子基因家族分析发现，其蛋白酶体基因和抑制因子基因家族数量大地相仿。然而，大小panda的蛋白酶体基因家族中，金属肽酶编码基因的比例更高，可能与其线虫分解竹子代谢物有关。相反，狮中的线虫具有较高分解蛋白的能力。此外，KEGG同路表明大小熊猫中的线虫通过增加两种通路的copy来抵抗竹子代谢后产物带来的不良影响。

3、关于使用PAML的选择分析

本研究中使用了5种不同的策略进行选择分析：1）小熊猫和大熊猫的作为前景枝，其他三种（猪、狗、虎）为后景（在PAML中的表现应该是用“#” 或者 【美元符号】标记大小熊猫线虫）。这可以探究食竹习性导致的选择位点。2）小熊猫作为前景。3）大熊猫作为前景。4）5个物种的共同祖先枝作为前景（也就是用“#”标记5条共同祖先枝），并用C. elegans, C. briggsae, and P. pacificus作为后景。5）将4）中的#改为$，也就是说不仅研究共同祖先枝，还研究现有的这5个物种，一起囊括进行分析。 （5）和（4）中，寄生性蛔虫是前景，而自由生活的蛔虫是后景。

进一步地，在策略（4）中筛选出196个受正选择的基因，然后通过best-hit，将其延展到87个线虫物种（包括寄生的和自由生活的），再通过alignment和计算频率来找到寄生型和自由生活型中有显著差异的氨基酸替换类型。通过GO分析发现，这些基因与生长繁殖发育的各个过程密切相关。

4、蛋白酶体、蛋白酶体抑制因子家族以及分泌组的鉴定：

blastP比对到MEROPS peptidase database，每个蛋白至少60 amino acids matched。用SignalP (Petersen et al. 2011), TargetP (Emanuelsson et al. 2000), and TMHMM (Krogh et al. 2001)预测分泌性蛋白，除去跨膜蛋白和线粒体序列后就是分泌组。

5、互作网络的建立方法：

以人的蛋白组为参考，用best-hit方法鉴定五个宿主物种中的orthologs。进一步筛选orthologs，只有胞外区域、血浆膜体系、小肠、肺泡中的蛋白被保留了，因为其他部位的蛋白不太可能参与与蛔虫的蛋白互作，这是宿主蛋白。根据上文找出的分泌组，再次通过BLAST best-hit 方法找出人类蛋白组中的对应orthologs。通过转换后的这两部分对应的人类orthologs，通过STRING database进行PPIs构建，保留了high-confidence PPIs (combined score > 0.7)，然后计算degree index (number of connections)进行评估。

图表：

(a)系统发育书以及基因家族的扩张和收缩，黄星是寄生性线虫，绿星是自由生活的。(b)不同蛋白酶体家族所占比例。（c）颜色为物种，纵轴为对用通路中的基因数量，横轴表示不同的KEGG注释类别。 （a）建立寄主、寄生生物蛋白互作（protein-protein interaction, PPI）网络关系的pipeline。（b）5组PPIs的维恩图。（c）CTSZ蛋白与的互寄主作网络，其中包括十分重要的MHC-II antigen presentation通路，能够降低寄主的免疫应答。（d）P4HB蛋白与宿主蛋白的互作网络，其中包括细胞表面整连蛋白互作通路，可能与蛔虫的内源化有关。 利用PPIs网络筛选出的186个蛋白互作对进行建树，只有七对有相同的拓扑，这七对蛋白可能与对抗性协同进化密切相关。但是总体上是不符合协同进化系统发育关系的。 5个体系中（5个物种对）蛋白互作程度的基因排名列表。